Генерация двухцветного Antigen микрочипов для одновременного определения IgG и IgM Аутоантитела

Резюме

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Аннотация

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Введение

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

протокол

1. разбавляя Антигены и генерации Антиген Microarrays

1. Развести антигены в PBS до конечной концентрации 0,2 мг / мл. Печать до 162 уникальных антигенов в двух экземплярах с конфигурацией microarrayer с 9-ю штырями. Включить IgG и IgM антигены в библиотеке антиген качестве положительного контроля. Включите PBS только в качестве отрицательного контроля.
2. Добавьте 20 мкл каждого антигена к 384 источника луночного планшета. Добавьте антигены к исходной пластине в группах , которые отражают установки печатающей головки (например, договоритесь антигены групп 9 , когда 9 штырьков используются для печати).
3. Крышка источника пластины с фольгой и заморозить при температуре -80 ° С до готовности к печати массивов.
4. Очистки твердых microarrayer штифты, при инкубировании их в ультразвуковую ванну, с деионизированной водой в течение 3 х 1 мин. Место булавки в стойке, чтобы высохнуть, а затем организовать контакты в микрочипов печатающей головки. За 9 штырьков, используйте конфигурацию 3 х 3.
5. Программа microarrayer для печати запуска путем установки цифровых контактов на печатающей головке,количество слайдов для печати, количество прокладок на каждом слайде, и количество повторных пятен для каждого антигена. Как правило, используют 9-контактный, 70 горок, 2 колодки / слайд и 2 дублирующие места для каждого антигена. Программа microarrayer на булавки в разрушать ультразвуком воде между различными группами антигенов.
6. Оттепель пластины источника, а затем центрифуге пластины в течение 1 мин при 100 х г. Поместите источник пластину в назначенном месте в microarrayer. Удалите участок фольги, которая покрывает первую группу антигенов, которые будут напечатаны.
7. Устройте непропечатанных скользит по поверхности arrayer и программы запуска печати. Печать слайдов при комнатной температуре с влажностью устанавливается на arrayer при 55 - 60% при сборке в увлажнителем машины массива.
8. После того, как каждая группа антигенов печатается на всех слайдов, пауза microarrayer. Накройте антигены, которые были только что напечатанные с фольгой (для предотвращения испарения) и раскрыть следующую группу антигенов, которые будут напечатаны. Продолжить программу печати.
9. После того, как все антигены были напечатаны, источник крышки плел с новым куском фольги и заморозить при температуре -80 ° С. Поместите напечатанные слайды в окне слайдов и вакуумное уплотнение. Слайды могут быть использованы на следующий день или до одного месяца позже.

2. Зондирование Antigen Microarrays с разбавленных сывороток

1. Поместите слайды в кадры с использованием инкубационных камер. Добавить 700 мкл блокирующего буфера (2,5% [об / об] эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 0,1% [об / об] твин 20 в PBS) для каждой поверхности массива.
2. Поместите клейкую пленку на раме и поместить в герметичный контейнер с куском влажной ткани. Выдержите O / N при 4 ° С на качалке.
3. Развести образцы сыворотки 1: 100 в блокирующем буфере. Отберите блокирующего раствора из массивов и добавить 500 мкл разведенного образца к каждой поверхности массива.
4. Покрытие с клейкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при 4 ° С с качалки.
5. Развести вторичными антителами в блокирующем буфере. Для получения человеческих исследований, разбавьте Су3 меченый козий антитела против человеческого IgG до 0,33 мкг / мл, и Cy5 меченый козий анти-HUMAN IgM-антитела к 0,25 мкг / мл. Для исследований на мышах, разбавьте Су3 меченый козий против мышиного IgG антитела к 0,38 мкг / мл и Cy5 меченый козий анти-мышиных IgM-антител до 0,7 мкг / мл.
6. Аспирируйте образцы из массивов и промыть поверхность массива 4 раза буфером для ополаскивания (0,1% Tween 20 в PBS). Налейте буфер на к слайдам и смахнуть быстро.
7. Добавить 700 мкл блокирующего буфера, чтобы вымыть каждую поверхность массива и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре с качалки. Повторите шаг мыть два раза больше.
8. Добавьте 500 мкл разведенной вторичного антитела к каждой поверхности скольжения и накрыть клейкой пленкой. Инкубировать 45 мин при 4 ° С с качалки.
9. Отберите вторичной смеси антител с горками и прополоскать в 4 раза выше. Вымойте слайды 3 раза 700 мкл блокирующего буфера / разбавления, как указано выше.
10. Удалить слайды из рамок и места в металлической стойке слайд, который погружают в PBS. Выдержите 20 мин при комнатной температуре с орбитальным встряхивании. Место в новом контейнере PBS и инкубировать еще 20 мв при встряхивании.
11. Место слайд стойку в контейнере деионизованной воды 15 сек. Поместите стойку в новый контейнер с водой и инкубировать еще 15 сек.
12. Для сухих слайдов, поместите слайд-штатив на пластине адаптера ELISA в центрифуге и спина при 220 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
13. Поместите слайды в светонепроницаемый ящик до готовности для сканирования.

3. Сканирование Антиген Microarrays и экспортирование данных

1. Сканирование слайдов с помощью сканера микрочипов, который может обнаружить Cy3 и Cy5 флуоресцентные сигналы. Для того, чтобы изменить уровень фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) сканера в, предварительно отсканировать слайд, который был только испытанные с вторичными антителами.
   Примечание: Этот слайд должен иметь полную библиотеку антигена, напечатанный на нем в том числе положительных (IgG и IgM), а также отрицательного контроля (PBS). Предварительное сканирование является низкое разрешение сканирования, что позволяет пользователю быстро найти оптимальные настройки PMT.
2. Установите значения PMT так, что IgG особенности человека (на канале Cy3) и гулН. особенности IgM (на канале Cy5), имеют аналогичные медианы интенсивности флуоресценции минус величина фонового (ПТР-B) (как правило, 40 000). Уровни PMT устанавливаются нажатием кнопки "аппаратного". После установки, сохранить эти настройки PMT постоянной.
3. Сканирование экспериментальных скользит по двум каналам, нажав на кнопку "SCAN". Сохраните слайд-изображения (оба канала) после каждого сканирования.
4. Загрузите слайд для анализа в программное обеспечение микрочипов с помощью кнопки "Файл".
5. Загрузите файл списка массива генов (GAL) с помощью кнопки "Файл". Файл GAL имеет расположение массива с идентичностей функций массива.
6. Поместите шаблон массива над отсканированного изображения таким образом, чтобы массивы функции соответствуют шаблону настолько близко, насколько это возможно.
7. Совместите функции во всех блоках с шаблоном, нажав на кнопку "Align". Программа, как правило, найти схему круговых функций, но некоторые ручные корректировки могут быть необходимы, Эти поправки могут быть сделаны путем ввода в режим функции. Программное обеспечение будет вычислять MFI-B для каждого из антигенов.
8. экспортировать эти результаты в виде текстового файла Используйте кнопку "Файл".

4. Анализ массива данных со значением анализа микрочипов (SAM)

1. Загрузите отдельные текстовые файлы в Excel и идентифицировать столбцы, которые имеют MFI-B для каналов Cy3 и Cy5.
2. Вычислить среднее значение для дублирующих функций.
3. Для любого отрицательного MFI-B, заменить отрицательное число с 10. Преобразование данных путем деления сырой MFI-B на 100, а затем путем вычисления логарифма по основанию 2.
4. Анализ лог - преобразованных данных со значением анализа микрочипов (SAM) , как описано выше ^7.
5. Для исследования с помощью двух групп (например, здоровых людей против пациентов), этикетки одна группа "1" и группа "2." Используйте два класса, непарный анализ в SAM, чтобы идентифицировать антигены, которые являются реакционные significantly отличается между двумя группами (Q значение <0,05).
6. Используйте кластерами и теплогенерирующего-карта программное обеспечение , чтобы сделать изображения для презентации ^8.

Результаты

Антигены расположены в 384 - луночный планшет и распечатываются на предметные стекла с помощью роботизированной microarrayer , как показано на рисунке 1. Рисунок 2 показывает слайды помещается в рамку с инкубаторе и отсканированного слайда после обработки. ?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, позволяет для количественного определения аутоантител с использованием метода антигена микрочипов. Антиген микрочипов имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционным методом ELISA в скрининг на аутоантитела. Во-первых, различные антигены, включая нуклеино?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)