IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray'ler Üretimi

Özet

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Özet

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Giriş

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protokol

1. Sulandırma antijen ve Yaratma Antijen Mikroarray'ler

1. 0.2 mg / ml'lik bir son konsantrasyona PBS içinde antijenleri seyreltilir. 9 iğneli bir mikro-dizici konfigürasyonu ile iki nüsha halinde 162 kadar benzersiz antijenleri yazdırın. antijen kitaplık olarak pozitif kontrol IgG ve IgM antijenleri ekleyin. Yalnızca bir negatif kontrol olarak PBS içerir.
2. 384 gözlü bir kaynak plaka her bir antijenin 20 ul ekle. Kafasının kurulumu ayna gruplar halinde kaynak plakasına antijenleri ekleyin (9 pimleri baskı için kullanıldığında, örneğin, 9 kişilik gruplar halinde antijenleri düzenlemek).
3. diziler yazdırmak için hazır olana kadar -80 ° C'de folyo ve dondurma ile kapak kaynak plakası.
4. 3 x 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile, bir sonikasyon banyosu içinde onları kuluçka katı mikro-dizici işaretçilerini temizleyin. rafa yerleştirin pimleri kurutun ve daha sonra mikroarray yazıcı kafasındaki işaretçilerine düzenlemek için. 9 pin için, 3 x 3 yapılandırmayı kullanın.
5. kafasının sayı işaretçilerine ayarlayarak tarafından işletilen baskı için program mikro-dizici,slaytlar sayısı her slaytta, pedleri numarasını yazdırmak ve her bir antijen için çoğaltmak lekelerin sayısı için. Tipik olarak, 9 işaretçilerine, 70 kaydırak, 2 pedleri / slayt ve her bir antijen için 2 suret noktalar kullanın. Program mikro-dizici antijenlerin farklı gruplar arasında suda işaretçilerine ses dalgalarına maruz için.
6. Çözülme kaynak plakası 100 x g, 1 dakika daha sonra santrifüj plaka. mikro dizicinin belirlenen noktada kaynak plaka koyun. Basılacak antijenlerin ilk grubu kapsayan folyo bölümünü kaldırın.
7. arrayer yüzeyi ve çalıştırma baskı programı baskısız slaytlar düzenleyin. Dizi makinesinin nemlendirici inşa ile% 60 - nem oda sıcaklığında baskı slaytlar 55 de arrayer ayarlanır.
8. antijenlerin her grup her slaytlarda basıldıktan sonra, mikro-dizici duraklatmak. sadece folyo ile basıldı antijenleri Kapak (buharlaşmasını önlemek için) ve antijenlerin sonraki grup basılacak ortaya çıkarmak. Baskı programına devam edin.
9. Tüm antijenler yazdırıldıktan sonra, kapak kaynak pl-80 ° C folyo ve dondurma yeni bir parça ile yedi. slayt kutu ve vakum mühür basılmış slaytlar yerleştirin. Slaytlar ertesi gün kullanılan veya en fazla bir ay sonra olabilir.

2. Seyreltik Sera ile Antijen mikrodizileri Probing

1. Kuluçka odaları kullanarak çerçevelerin içine slaytlar yerleştirin. Her bir dizi yüzey engelleme tamponu (% 2.5 [hacim / hacim] fetal buzağı serumu (FCS), PBS içinde Tween 20,% 0.1 [/ hacim: hacim]) 700 ul ekle.
2. Islak bir doku parçası ile kapalı bir kapta çerçeve ve yerde yapışkan film yerleştirin. bir rocker 4 ° C'de O / N inkübe edin.
3. Serum örnekleri 1 sulandırmak: 100 tampon engelleme. Aspire dizilerden engelleme çözümü ve her dizi yüzeyine seyreltilmiş örnek 500 ul ekleyin.
4. yapışkan film ile örtün ve sallanan 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir.
5. tampon engelleme ikincil antikorlar seyreltilir. İnsan deneyleri için, 0.33 mg / ml ve Cy5 bir Cy3 etiketli keçi anti-insan IgG antikoru seyreltilmiş keçi anti-Huma etiketli0.25 ug / ml IgM antikoru n. Fare çalışmaları için, bir Cy3 mi 0.38 ug / keçi anti-fare IgG antikoru etiketlenmiş ve bir Cy5 / ml 0.7 ug keçi anti-fare IgM antikoru etiketli seyreltin.
6. dizileri aspire örnekler ve dizi yüzeyleri durulama tamponu (PBS içerisinde% 0.1 Tween 20) ile 4 kez yıkayın. slaytlar üzerine tampon ve çabuk fiske dökün.
7. sallanan oda sıcaklığında her dizi yüzeyini yıkamak ve 10 dakika inkübe etmek blokaj tamponu 700 ul ekle. Tekrarlayın yıkama adımı iki kez daha.
8. Her slayt yüzeyine seyreltilmiş ikincil antikor 500 ul ekleyin ve yapışkan film ile kaplayın. sallanan 4 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
9. Aspire ikincil antikor slaytlar gelen karışım ve yukarıdaki gibi 4 kez yıkayın. Yıkama yukarıdaki gibi engelleme / seyreltme tamponu 700 ul ile 3 kez kayar.
10. PBS batırılır metal slayt raf çerçeveleri ve yerden slaytları çıkarın. yörünge çalkalama ile oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkalayın. PBS yeni kapta koyun ve başka bir 20 m inkübesallayarak ile.
11. deiyonize su 15 saniye bir kap içine koyun slayt raf. su, yeni bir kapta raf yerleştirin ve başka bir 15 saniye kuluçkaya yatmaktadır.
12. Kuru slaytlar, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 220 xg'de santrifüj ve spin bir ELISA plakası adaptörü üzerindeki yeri slayt rafa.
13. tarama için hazır olana kadar ışık geçirmez kutu slaytlar yerleştirin.

3. Tarama Antijen Mikroarray'ler ve İhracat Verileri

1. Cy3 ve Cy5 floresan sinyalleri algılayabilen bir mikrodizi tarayıcı kullanarak tarama slaytlar. Tarayıcının photomultiplier tüp (PMT) seviyesini ayarlamak için, sadece sekonder antikor ile problanmıştır bir slayt önceden tarayın.
   Not: Bu slayt tam pozitif (IgG ve IgM) de dahil olmak üzere basılmış antijen kütüphanesi yanı sıra negatif (PBS) kontrolleri olmalıdır. ön tarama optimum PMT ayarlarını bulmak için hızlı bir şekilde kullanıcı sağlayan bir düşük çözünürlüklü tarama olduğunu.
2. PMT değerlerini ayarlayın, böylece (Cy3 kanalında) insan IgG özellikleri ve uğultu(Cy5 kanalında) bir IgM özellikleri benzer medyan floresan eksi arka plan (MFI-B) (tipik olarak 40.000) var. PMT düzeyleri "donanım" düğmesine basarak ayarlanır. ayarlandıktan sonra, sabit bu PMT ayarları korumak.
3. "Tarama" tuşuna basarak iki kanal deneysel slaytlar tarayın. Her taramadan sonra slayt görüntüleri (iki kanal) kaydedin.
4. slayt yükle "Dosya" düğmesini kullanarak mikroarray yazılımı içine analiz edilecek.
5. "Dosya" düğmesini kullanarak gen dizisi listesi (GAL) dosyasını yükleyin. GAL dosya dizisi özellikleri kimlikleri ile dizinin düzeni vardır.
6. diziler özellikleri mümkün olduğunca yakından şablonu eşleşecek şekilde taranan görüntünün üzerine dizi şablonu yerleştirin.
7. "Hizalama" düğmesine basarak şablonu ile tüm bloklarda özellikleri aynı hizaya getirin. Program genellikle dairesel özellikleri anahat bulacaksınız ama bazı manuel ayarlamalar gerekebilir. Bu ayarlamalar özellik moduna girerek yapılabilir. Yazılım daha sonra antijenlerin her biri için bir MFI-B hesaplar.
8. Bir metin dosyası olarak bu sonuçları ihracat "dosya" düğmesini kullanın.

Mikroarray'ler Önemi Analizi ile 4. Analiz Dizi Verileri (SAM)

1. excel içine tek metin dosyaları yüklemek ve Cy3 ve Cy5 kanalları için MFI-B var sütunları belirlemek.
2. yinelenen özellikler için ortalama hesaplayın.
3. herhangi bir olumsuz MFI-B, 10 ile negatif sayı günlük tabanı 2 hesaplayarak sonra 100 ile ham MFI-B bölünmesi ve verileri Transform değiştirin.
4. Daha önce ⁷ açıklandığı gibi Mikroarray'ler (SAM) Önemi Analizi ile günlük dönüştürülmüş verileri analiz edin.
5. Iki grup (örneğin, sağlıklı kontrol vs hasta), etiket bir grup "1" ve grup kullanarak bir çalışma için "2." ler vardır antijenler reaksiyonlarını belirlemek için SAM iki sınıf, eşleşmemiş analizini kullanınHer iki grup arasında önemli ölçüde farklıdır (q <0.05).
6. Sunum ⁸ görüntüleri yapmak için kümeleme ve ısı haritası üreten yazılımını kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1'de gösterildiği gibi antijenler bir robot mikro dizicinin tarafından Slaytlarınıza 384 plaka olarak düzenlenmiş ve yazdırılır. 2 inkübasyon odaları ve işlenmesinden sonra taranmış bir slayt ile bir çerçeve içinde yerleştirildi slaytlar göstermektedir. 3 pozitif ve negatif kontrol slaytlar göstermektedir. Negatif bir slayt, sadece sekonder antikor ile incelendi ve pozitif...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol antijen mikrodizi tekniği kullanılarak otoantikorlann ölçümü sağlar. Antijen mikrodizileri otoantikorlar için eleme testi esnasında klasik ELISA göre birçok avantajı vardır. Her şeyden önce, nükleik asitler, proteinler, peptidler ve hücre lizatları dahil çeşitli antijenlere ve böylece oto antikorların çoğaltılmış çok katlı taranması için izin nitroselüloz kaplı slaydlar üzerine dizilmiş olabilir. antijen nanolitre Her bir slayt üzerine fark vardır Ek olara...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)