의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

요약

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

초록

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

서문

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

프로토콜

1. 희석 항원 및 생성 항원 마이크로 어레이

1. 0.2 mg / ml의 최종 농도로 PBS에 희석 항원. 9 핀과 미세 배열 구성과 중복에서 162까지 고유의 항원을 인쇄합니다. 항원 라이브러리로 양성 대조군에서의 IgG 및 IgM의 항원을 포함합니다. 단지 음성 대조군으로 PBS를 포함합니다.
2. 384 잘 소스 판에 각 항원의 20 μl를 추가합니다. 프린트 헤드의 설치 미러 그룹의 소스 플레이트에 항원을 추가 (9 핀 인쇄에 사용하는 경우 등, (9)의 그룹이 항원을 준비).
3. 배열을 인쇄 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 박 및 동결와 커버 소스 판.
4. 3 × 1 분 동안 탈 이온수와 초음파 처리 조에서이를 배양하여 고체 미세 배열 핀을 청소합니다. 랙에 배치 핀은 건조 후 마이크로 어레이 프린트 헤드의 핀을 배치합니다. 9 핀, 3 × 3 구성을 사용합니다.
5. 프린트 헤드 번호 핀을 설정하여 실행 인쇄 프로그램 미세 배열,슬라이드의 수는 각 슬라이드에, 패드의 번호를 인쇄하고, 각 항원에 대한 복제 지점 수 있습니다. 일반적으로 9 핀, 70 슬라이드, 2 패드 / 슬라이드, 각 항원에 대한 2 복제 지점을 사용합니다. 프로그램 미세 배열은 항원의 다른 그룹 사이에 물에 핀을 초음파 처리합니다.
6. 해동 소스 플레이트와 100 × g에서 1 분 후 원심 분리 판. 미세 배열의 지정된 자리에 소스 판을 놓습니다. 인쇄 할 항원의 첫 번째 그룹을 덮고 박의 부분을 제거합니다.
7. Arrayer에 표면 및 실행 인쇄 프로그램에 인쇄되지 않은 슬라이드를 정렬합니다. 어레이 시스템의 가습기의 빌드 60 % - 습도 RT에서 인쇄 슬라이드 (55)에 Arrayer에에 설정합니다.
8. 항원의 각 그룹은 모든 슬라이드 상에 인쇄 된 후, 미세 배열을 일시. 다만 호일로 인쇄 된 표지 항원 (증발을 방지하기 위해) 및 항원의 다음 그룹에 인쇄 될 발견. 인쇄 프로그램을 계속합니다.
9. 모든 항원에 인쇄 한 후, 커버 소스 PL-80 ° C에서 박 및 동결의 새로운 조각을 먹었다. 슬라이드 상자와 진공 밀봉에 인쇄 된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 다음날를 사용하거나 최대 한 달 후에 할 수있다.

2. 희석 혈청과 항원 마이크로 어레이를 프로빙

1. 배양 챔버를 사용하여 프레임으로 슬라이드를 놓습니다. 각 배열 표면에 차단 버퍼 (2.5 %의 [권 / 권] 태아 혈청 (FCS), PBS에 트윈 20 0.1 % [의 / 권 권])의 700 μl를 추가합니다.
2. 젖은 조직의 조각 밀폐 용기에 프레임과 장소를 통해 접착 필름을 배치합니다. 로커에 4 ° C에서 O / N을 품어.
3. 혈청 샘플 1을 희석 : (100) 버퍼를 차단에서. 대기음 배열에서 솔루션을 차단 및 각 배열 표면에 희석 한 시료 500 μl를 추가합니다.
4. 접착 필름으로 덮고 락으로 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
5. 버퍼를 차단에서 이차 항체를 희석. 인간 연구의 경우, 0.33 μg의 / ㎖ 및 Cy5에로 Cy3가 표지 된 염소 항 - 인간 IgG 항체가 희석 된 염소 항 - 구호 물자 표지0.25 μg의 / ㎖에 대한 IgM 항체 n은. 마우스 연구를 들면, Cy3에가 ㎖의 0.38 μg의 /에 염소에게 항 - 마우스 IgG 항체를 표지와 Cy5에가 / ㎖ 0.7 μg의에 염소 항 - 마우스 IgM의 항체를 표지 희석.
6. 어레이에서 대기음 샘플 및 배열 표면을 세척 완충액 (PBS 중 0.1 % 트윈 20)로 4 회 헹군다. 슬라이드에 버퍼 빠르게 떨어져 가볍게 붓는다.
7. 락과 RT에서 각 배열 표면을 씻어 10 분 부화 버퍼를 차단의 700 μl를 추가합니다. 반복 세척 단계를 두 번 더.
8. 각 슬라이드 표면에 희석 차 항체의 500 μl를 추가하고 접착 필름 커버. 락과 4 ° C에서 45 분을 품어.
9. 대기음 차 항체 슬라이드에서 혼합하고 위의 4 번 헹군다. 워시는 상기 차단 / 희석액 700 ㎕를 3 번​​ 슬라이드.
10. PBS에 침지 금속 슬라이드 랙 프레임과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. 궤도 흔들림와 실온에서 20 분을 품어. PBS의 새로운 용기에 놓고 다른 20m를 품다진탕한다.
11. 탈 이온수 15 초 용기에 넣어 슬라이드 랙. 물이 새 컨테이너에 선반을 놓고 다른 15 초를 품어.
12. 건조 슬라이드, RT에서 5 분 220 XG에 원심 분리기와 스핀에서 ELISA 플레이트 어댑터에 장소 슬라이드 랙.
13. 스캔 할 준비가 될 때까지 빛을 꽉 상자에 슬라이드를 놓습니다.

3. 스캔 항원 마이크로 어레이 및 데이터 내보내기

1. 를 Cy3 및 Cy5의 형광 신호를 검출 할 수있는 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔 슬라이드. 스캐너의 광전자 증 배관 (PMT) 레벨을 조정하기 위해, 단지 이차 항체로 프로빙 하였다 슬라이드 사전 스캔.
   참고 :이 슬라이드 전체 양 (IgG에와 IgM의)를 포함하여 그것에 인쇄 항원 라이브러리뿐만 아니라 음 (PBS) 컨트롤이 있어야합니다. 프리 스캔 최적 PMT 설정을 찾기 위해 신속하게 사용자를 허용하는 낮은 해상도로 스캔한다.
2. PMT를 값을 설정되도록합니다 (Cy3에 채널에서) 인간 IgG 기능과 잡음합니다 (Cy5에 채널)을 IgM의 기능은 비슷한 평균 형광 강도를 뺀 배경 (MFI-B) (일반적으로 40000)가 있습니다. PMT를 레벨은 "하드웨어"버튼을 누름으로써 설정된다. 일단 설정되면, 일정이 PMT 설정을 유지.
3. 은 "스캔"버튼을 누름으로써 두 개의 채널에 대한 실험 슬라이드 스캔. 각 스캔 한 후 슬라이드 이미지 (두 채널 모두)를 저장합니다.
4. 슬라이드를로드하는 "파일"버튼을 사용하여 마이크로 어레이 소프트웨어로 분석된다.
5. "파일"버튼을 이용하여 유전자 배열 목록 (GAL) 파일을로드합니다. 는 GAL 파일 어레이 피처들의 신원을 가진 어레이의 레이아웃을 가진다.
6. 배열 기능을 최대한 가깝게 템플릿을 일치하도록 스캔 한 이미지를 통해 배열 템플릿을 놓습니다.
7. 은 "정렬"버튼을 눌러 템플릿으로 모든 블록의 기능을 맞 춥니 다. 프로그램은 일반적으로 원형의 기능의 개요를 확인할 수 있지만, 일부 수동 조정이 필요할 수있다. 이러한 조정 기능 모드를 입력 할 수있다. 소프트웨어는 각 항원에 대해 MFI-B를 계산한다.
8. 텍스트 파일로 결과를 내보내려면 "파일"버튼을 사용합니다.

마이크로 어레이의 의미 분석 4. 분석 배열 데이터 (SAM)

1. 엑셀로 개별 텍스트 파일을로드하고를 Cy3와 Cy5에 채널 MFI-B가 열을 식별합니다.
2. 중복 기능의 평균을 계산합니다.
3. 어떤 부정적인 MFI-B의 경우, (10)와 음수 로그베이스 (2)를 계산하여 다음 100 원 MFI-B를 나누고하여 데이터를 변환 대체합니다.
4. 이전에 ⁷ 설명한 바와 같이 마이크로 어레이 (SAM)의 의미 분석과 로그 변환 된 데이터를 분석 할 수 있습니다.
5. 두 그룹 (예를 들어, 건강한 대조군 대 명), 하나의 그룹 라벨 「1」및 그룹을 이용하여 연구를위한 "2" 의있는 항원의 반응성을 식별하기 위해 SAM의 두 클래스 짝이 분석을 사용하여두 군간 ignificantly 다른 (Q 값 <0.05).
6. 프리젠 테이션 ⁸ 이미지를 만들기 위해 클러스터링 및 열 맵 생성 소프트웨어를 사용합니다.

결과

도 1에 나타낸 바와 같이 항원 로봇 미세 배열로 슬라이드 상에 384 웰 플레이트에 배치되어 인쇄된다. 2는 배양 챔버와 처리 후의 스캔 슬라이드 프레임에 배치 된 슬라이드를 나타낸다. (3) 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 나타낸다. 네가티브 슬라이드은 이차 항체로 프로빙하고, 양성 대조군 슬라이드 전신?...

토론

여기에 설명 된 프로토콜 항원 마이크로 어레이 기술을 이용하여자가 항체의 정량을 허용한다. 항원 마이크로 어레이는자가 항체 선별에 기존의 ELISA에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 우선, 핵산, 단백질, 펩티드, 및 세포 용 해물을 포함하는 다양한 항원에 따라서 다중화자가 항체 스크리닝을 허용 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드 상에 배치 될 수있다. 항원 나노 리터 각 슬라이드에 발견?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)