Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Zusammenfassung

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Zusammenfassung

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Einleitung

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protokoll

1. Diluting Antigene und Generierung von Antigen-Mikroarrays

1. Verdünnte Antigene in PBS auf eine Endkonzentration von 0,2 mg / ml. Drucken Sie bis zu 162 einzigartige Antigene in zweifacher Ausfertigung mit einer Microarrayers Konfiguration mit 9 Pins. Umfassen IgG- und IgM-Antigene in den Antigen-Bibliothek als positive Kontrollen. Umfassen PBS nur als negative Kontrolle.
2. In 20 ul jedes Antigen an die 384-Well-Source-Platte. In Antigene an der Source - Platte in Gruppen, die den Aufbau des Druckkopf spiegeln (zB ordnen Antigene in Gruppen von 9 , wenn 9 Pins für den Druck verwendet werden).
3. Abdeckung Source-Platte mit Folie und Einfrieren bei -80 ° C bis bereit Arrays zu drucken.
4. Reinigen Sie feste Microarrayers Stifte, indem sie in einem Ultraschallbad mit VE-Wasser für 3 x 1 min inkubiert. Platz Stifte in Rack zu trocknen und dann Stifte in Microarray-Druckkopf anordnen. Für 9-polig, mit einem 3 x 3-Konfiguration.
5. Programm Microarrayers für den Druck laufen nach Anzahl Pins auf Druckkopfeinstellung,Anzahl der Folien auf jeder Folie Anzahl der Kissen und die Anzahl der Wiederholungs spots für jedes Antigen zu drucken. Normalerweise verwenden 9-polig, 70 Rutschen, 2 Pads / Rutsche und zwei Wiederholungsspots für jedes Antigen. Programm Microarrayers zu beschallen pins in Wasser zwischen verschiedenen Gruppen von Antigenen.
6. Thaw Source-Platte und dann Zentrifuge Platte für 1 min bei 100 x g. Platzieren Sie Quellenplatte in dafür vorgesehenen Stelle in Microarrayers. Entfernen Sie den Abschnitt der Folie, die die erste Gruppe von Antigenen bedeckt gedruckt werden.
7. Vereinbaren ungedruckten gleitet auf Arrayers Oberfläche und Laufdruckprogramm. Drucken von Folien bei RT mit Feuchtigkeit setzen auf der Arrayers bei 55-60% mit dem eingebauten Luftbefeuchter der Array-Maschine.
8. Nachdem jede Gruppe von Antigenen auf alle Folien gedruckt wird, unterbrechen Sie die Microarrayers. Decken Sie die Antigene, die wurden nur mit Folie gedruckt (zur Verhinderung von Verdunstung) und entdecken die nächste Gruppe von Antigenen gedruckt werden. Weiter Druckprogramm.
9. Nachdem alle Antigene gedruckt wurden, decken Quelle plaß mit neuen Stück Folie und Einfrieren bei -80 ° C. Legen Sie gedruckte Folien in Gleitkastens und Vakuumdichtung. Die Objektträger können am nächsten Tag verwendet werden oder bis zu einen Monat später.

2. Probing Antigen-Mikroarrays mit verdünntem Sera

1. Die Objektträger in Rahmen mit Inkubationskammern. Hinzufügen, 700 & mgr; l Blockierungspuffer (2,5% [vol / vol] fötalem Kälberserum (FCS), 0,1% [v / v] Tween 20 in PBS) zu jeder Array-Oberfläche.
2. Platzieren Klebefolie über Rahmen und in einem verschlossenen Behälter mit einem Stück feuchten Tuchs. Inkubieren O / N bei 4 ° C auf einer Wippe.
3. Verdünnte Serumproben 1: 100 in Blockierungspuffer. Absaugen Blocking-Lösung von Arrays und 500 ul verdünnte Probe zu jedem Array-Oberfläche hinzuzufügen.
4. Mit Klebefolie abdecken und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C mit Schaukeln.
5. Verdünnen Sekundärantikörper in Blocking-Puffer. Für Humanstudien, verdünntem eine Cy3 markiertes Ziegen anti-human IgG-Antikörpers auf 0,33 & mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-human IgM-Antikörper 0,25 ug / ml. Für Maus-Studien, verdünntem a Cy3 Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper auf 0,38 & mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-Maus IgM Antikörper auf 0,7 & mgr; g / ml markiert.
6. Aspirat Proben von Arrays und Array spülen Oberflächen 4mal mit Spülpuffer (0,1% Tween 20 in PBS). Gieße auf, um Dias Puffer und schnell wegwedeln.
7. In 700 l Blocking-Puffer jedes Array-Oberfläche zu waschen und 10 min bei RT inkubieren mit Schaukeln. Wiederholen Waschschritt zwei weitere Male.
8. In 500 ul verdünnt sekundären Antikörper zu jeder Gleitfläche und Abdeckung mit Klebefolie. Inkubiere 45 Minuten bei 4 ° C unter Schütteln.
9. Absaugen sekundären Antikörper Mischung aus Dias und 4 mal spülen, wie oben. Wasch gleitet 3-mal mit 700 & mgr; l Blockierungs / Verdünnungspuffer wie oben.
10. Die Objektträger aus Rahmen und in Metallschlitten-Rack, das in PBS eingetaucht ist. Inkubieren 20 min bei RT mit orbitalen Schütteln. Der Platz im neuen Container von PBS und Inkubation weitere 20 min unter Schütteln.
11. Den Objektträger-Rack in Behälter von entsalztem Wasser 15 sec. Legen Sie Rack in einem neuen Behälter mit Wasser und Inkubation weitere 15 sec.
12. Um trockene Rutschen, Platz Dia-Rack auf einem ELISA-Plattenadapter in Zentrifuge und Spin bei 220 × g für 5 min bei RT.
13. Die Objektträger in lichtdichten Box bis zum Scannen bereit.

3. Scannen Antigen-Mikroarrays und Exportieren von Daten

1. Scannen von Dias einen Microarray-Scanner verwenden, die Cy3 und Cy5 Fluoreszenzsignale erkennen kann. Um die Fotovervielfacherröhre (PMT) Ebenen des Scanners, Pre-Scan eine Folie einzustellen, die nur mit sekundären Antikörpern sondiert wurde.
   Hinweis: Diese Folie, um das vollständige Antigen-Bibliothek auf sie einschließlich positiv (IgG und IgM) sowie negative (PBS) Kontrollen gedruckt haben sollte. Die Pre-Scan ist eine niedrige Auflösung scannen, die dem Benutzer ermöglicht, schnell die optimale PMT-Einstellungen zu finden.
2. Stellen Sie die PMT-Werte, so dass die menschliche IgG-Features (auf dem Cy3-Kanal) und das Brummenein IgM-Features (auf dem Cy5-Kanal) haben eine ähnliche mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund (MFI-B) (typischerweise 40.000). Die PMT Ebenen werden durch Drücken der "Hardware" Taste eingestellt. Einmal eingestellt, halten Sie diese PMT-Einstellungen konstant.
3. Scannen Sie die experimentellen Dias auf den beiden Kanälen durch die "Scan" -Taste drücken. Speichern Sie die Dia-Bilder (beide Kanäle) nach jedem Scan.
4. Legen Sie die Folie werden in der Microarray-Software analysiert, indem die "Datei" Taste.
5. Laden Sie die Gen-Array-Liste (GAL) Datei, indem Sie die "Datei" Taste. Die GAL-Datei hat das Layout des Arrays mit den Identitäten der Array-Funktionen.
6. Platzieren des Arrays Schablone über dem gescannten Bild so, dass die Arrays Merkmale der Vorlage möglichst genau übereinstimmen.
7. Richten Sie Funktionen in allen Blöcken mit der Vorlage durch die "align" Taste drücken. Das Programm wird im allgemeinen die Kontur der Kreis Merkmale finden aber einige manuelle Anpassungen erforderlich sein können,. Diese Einstellungen können durch Eingabe der Feature-Modus vorgenommen werden. Die Software wird dann eine MFI-B für jedes der Antigene berechnen.
8. Verwenden Sie die "Datei", um diese Ergebnisse als eine Textdatei zu exportieren.

4. Analysieren Array Daten Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM)

1. Legen Sie einzelne Textdateien in Excel und identifizieren Sie die Spalten, die MFI-B für die Cy3 und Cy5-Kanälen.
2. Berechnen Sie den Durchschnitt der doppelten Funktionen.
3. Für jede negative MFI-B, ersetzen die negative Zahl mit 10 Daten-Transformation von rohen MFI-B durch 100 dividiert und dann durch log Basis 2 berechnet wird.
4. Analysieren Sie log transformierten Daten mit Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM) , wie zuvor ⁷ beschrieben.
5. Für eine Studie mit zwei Gruppen (zB gesunde Kontrollen vs. Patienten), Etikett einer Gruppe "1" und die Gruppe "2." Verwenden Sie eine Zwei-Klassen, ungepaarten Analyse in SAM auf Antigene zu identifizieren, die Reaktivitäten significantly unterschiedlich zwischen den beiden Gruppen (q-Wert <0,05).
6. Verwenden Sie Clustering und Wärme-Kartenerzeugungs Software machen Bilder für die Präsentation ^8.

Ergebnisse

Antigene werden in einer 384 - Well - Platte und auf Objektträger gedruckt von einem Roboter Microarrayers angeordnet , wie in 1 gezeigt ist , Fig . 2 gleitet in einem Rahmen mit Inkubationskammern und einem abgetasteten Objektträger nach der Verarbeitung plaziert zeigt, Fig . 3 zeigt , positive und negative Kontrollobjektträger. Der negative Schieber nur mit sekundären Antikörpern sondiert, und die...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Autoantikörper, die das Antigen Microarray-Technik verwendet wird. Antigen-Mikroarrays bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA in für Autoantikörper-Screening. Zunächst einmal eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich Nukleinsäuren, Proteine, Peptide und Zelllysate können auf die Nitrocellulose beschichtete Objektträger angeordnet werden, so dass für gemultiplexte Screening von Autoantikörpern ermöglicht. Darüber hinaus sin...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)