Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

Résumé

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Résumé

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Introduction

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protocole

1. dilution Antigènes Generating Antigène Microarrays

1. Diluer les antigènes dans du PBS à une concentration finale de 0,2 mg / ml. Imprimer jusqu'à 162 antigènes uniques en double avec une configuration de puces à ADN de 9 broches. Inclure des IgG et IgM antigènes présents dans la banque d'antigène comme témoins positifs. Inclure PBS seulement comme un contrôle négatif.
2. Ajouter 20 pi de chaque antigène au puits plaque source 384. Ajouter des antigènes à la plaque de source dans des groupes qui reflètent la configuration de la tête d' impression (par exemple, disposer d' antigènes dans des groupes de 9 quand 9 broches sont utilisées pour l' impression).
3. Plaque de source avec une feuille et le gel à -80 ° C jusqu'à ce que prêt à imprimer des tableaux.
4. Nettoyer les repères de la microarrayer solides en les incubant dans un bain de sonication avec de l'eau déminéralisée pendant 3 x 1 min. La place des broches dans le rack à sécher et ensuite organiser des épingles dans microarray tête d'impression. Pour 9 broches, utilisez une configuration 3 x 3.
5. microarrayer de programme pour le tirage en réglant les repères de numéro sur la tête d'impression,nombre de diapositives à imprimer, le nombre de plaquettes sur chaque diapositive, et le nombre de taches réplicats pour chaque antigène. En règle générale, utiliser 9 broches, 70 diapositives, 2 pads / slide, et 2 spots réplicats pour chaque antigène. microarrayer du programme à Soniquer épingles dans l'eau entre les différents groupes d'antigènes.
6. plaque source Thaw et la plaque puis centrifuger pendant 1 min à 100 x g. Placer la plaque de source endroit désigné dans microarrayer. Retirer la partie de la feuille qui recouvre le premier groupe d'antigènes à imprimer.
7. Disposer les diapositives non imprimées sur la surface de arrayer et l'exécution du programme d'impression. Imprimer des diapositives à la température ambiante avec une humidité réglées sur le arrayer à 55 - 60% avec la construction dans l'humidificateur de la machine à matrice.
8. Après chaque groupe d'antigènes est imprimé sur toutes les diapositives, mettre en pause le microarrayer. Couvrir les antigènes qui ont été simplement imprimées avec du papier (pour éviter l'évaporation) et de découvrir le prochain groupe d'antigènes à imprimer. Poursuivre le programme d'impression.
9. Après tous les antigènes ont été imprimés, source de couverture plmangé avec le nouveau morceau de papier et le gel à -80 ° C. Placez les diapositives imprimées dans la boîte coulissante et joint à vide. Les lames peuvent être utilisés le lendemain ou jusqu'à un mois plus tard.

2. Sonder Antigène Microarrays avec Dilué Sera

1. Placez les diapositives dans des cadres à l'aide de chambres d'incubation. Ajouter 700 pi de tampon de blocage (2,5% [vol / vol] fœtal de sérum de veau (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 dans du PBS) à chaque surface de la matrice.
2. Placez un film adhésif sur le cadre et le placer dans un récipient hermétique avec un morceau de tissu humide. Incuber O / N à 4 ° C sur une bascule.
3. Diluer les échantillons de sérum 1: 100 dans un tampon de blocage. Aspirer la solution de blocage de tableaux et ajouter 500 ul d'échantillon dilué dans chaque surface de la matrice.
4. Couvrir avec un film adhésif et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec balancement.
5. Diluer Anticorps secondaires dans un tampon de blocage. Pour les études sur l'homme, on dilue un anticorps IgG de chèvre marqué au Cy3 antihumain à 0,33 pg / ml et une Cy5 de chèvre marqué anti human IgM à 0,25 ug / ml. Pour les études sur la souris, diluer une Cy3 de chèvre marqué à l'anticorps anti-IgG de souris à 0,38 pg / ml et un anticorps marqué par Cy5 IgM anti-souris de chèvre à 0,7 pg / ml.
6. Aspirer échantillons à partir des tableaux et rincer les surfaces du tableau 4 fois avec un tampon de rinçage (0,1% de Tween 20 dans du PBS). Verser le tampon sur des diapositives et feuilleter rapidement.
7. Ajouter 700 pi de tampon de blocage pour laver chaque surface de la matrice et incuber 10 min à température ambiante avec bascule. Répétez l'étape de lavage deux fois de plus.
8. Ajouter 500 pi d'anticorps secondaire dilué dans chaque surface de glissement et couvrir avec un film adhésif. Incuber 45 min à 4 ° C avec balancement.
9. Aspirer mélange secondaire d'anticorps à partir de diapositives et rincer 4 fois comme ci-dessus. Laver les lames 3 fois avec 700 pi de tampon de blocage / de dilution comme ci-dessus.
10. Retirer les lames de cadres et les placer dans la grille coulissante métallique qui est immergé dans du PBS. Incuber 20 min à température ambiante avec agitation orbitale. Placer dans le nouveau conteneur de PBS et incuber une autre 20 mavec agitation.
11. Placer la grille coulissante dans un récipient d'eau désionisée 15 sec. Placer la grille dans un nouveau récipient d'eau et incuber une autre 15 sec.
12. Pour diapositives sèches, lieu glisser la grille sur un adaptateur de plaque ELISA dans la centrifugeuse et de spin à 220 g pendant 5 min à température ambiante.
13. Placez les diapositives dans une boîte étanche à la lumière jusqu'au moment de la numérisation.

3. Numérisation Antigène Microarrays et exportation de données

1. Numériser diapositives à l'aide d'un scanner de puces à ADN permettant de détecter des signaux fluorescents Cy3 et Cy5. Afin d'ajuster les niveaux tube photomultiplicateur (PMT) du scanner, pré-numériser une diapositive qui n'a été sondé avec des anticorps secondaires.
   Note: Cette diapositive doit avoir la bibliothèque de l'antigène complet imprimé sur elle, y compris positive (IgG et IgM) et négatifs (PBS) contrôles. Le pré-scan est un balayage à basse résolution qui permet à l'utilisateur de trouver rapidement les réglages optimaux PMT.
2. Définissez les valeurs PMT de sorte que les traits humains IgG (sur le canal Cy3) et le bourdonnementune des caractéristiques IgM (sur le canal Cy5) ont une même intensité de fluorescence médiane moins arrière-plan (MFI B), (typiquement 40 000). Les niveaux PMT sont réglés en appuyant sur le bouton "hardware". Une fois réglée, conserver ces paramètres de PMT constant.
3. Numérisez les diapositives expérimentales sur les deux canaux en appuyant sur le bouton "scan". Enregistrez les images de diapositives (les deux canaux) après chaque balayage.
4. Chargez la diapositive à analyser dans le logiciel de microréseaux en utilisant le bouton "fichier".
5. Chargez la liste de réseaux de gènes (GAL) fichier en utilisant le bouton "fichier". Le fichier GAL a la mise en page du tableau avec les identités des caractéristiques du tableau.
6. Placez le gabarit de tableau sur l'image numérisée de telle sorte que les tableaux caractéristiques correspondent aussi étroitement le modèle que possible.
7. Alignez fonctionnalités dans tous les blocs avec le modèle en appuyant sur le bouton "align". Le programme trouvera généralement les grandes lignes des caractéristiques circulaires mais certains réglages manuels peut être nécessaire. Ces ajustements peuvent être faits en entrant dans le mode de fonction. Le logiciel calcule ensuite un MFI B pour chacun des antigènes.
8. Utilisez le bouton "Fichier" pour exporter ces résultats sous forme de fichier texte.

4. Les données Analyse de tableau avec l'analyse de signification de Microarrays (SAM)

1. Charger des fichiers texte individuels dans Excel et d'identifier les colonnes qui ont MFI-B pour les canaux Cy3 et Cy5.
2. Calculer la moyenne pour les fonctions en double.
3. Pour toute négative MFI-B, remplacer le nombre négatif avec 10. Transformer les données en divisant brutes MFI-B par 100 et puis en calculant log base 2.
4. Analyser journal des données transformées avec l' analyse de signification de Microarrays (SAM) comme décrit précédemment ^7.
5. Pour une étude utilisant deux groupes (par exemple, des contrôles sains contre patients), l' étiquette d' un groupe "1" et le groupe "2." Utilisez un bi-classe, l'analyse apparié dans SAM pour identifier les antigènes réactivités qui sont significantly différente entre les deux groupes (valeur de q <0,05).
6. Utilisez le regroupement et la chaleur carte de génération de logiciels pour faire des images pour la présentation ^8.

Résultats

Les antigènes sont disposés dans une plaque à 384 puits et imprimés sur des lames par un microarrayer robotisé comme représenté sur la figure 1. La figure 2 montre des diapositives placées dans un cadre avec des chambres d'incubation et d' une lame numérisée après traitement. La figure 3 montre des lames de contrôle positif et négatif. La diapositive négative est seulement sondé avec des anticorps secondaires, et l...

Discussion

Le protocole décrit ici permet la quantification d'auto-anticorps en utilisant la technique des puces à ADN antigène. microréseaux d'antigènes offrent plusieurs avantages par rapport à ELISA classique dans le dépistage des auto-anticorps. Tout d'abord, une variété d'antigènes, y compris des acides nucléiques, des protéines, des peptides, et les lysats cellulaires peuvent être revêtus sur les lames de nitrocellulose revêtu, permettant ainsi de criblage d'auto-anticorps multiplexé. En o...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)