منهج في استخراج أصباغ من الحبار<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Summary

ويرد بروتوكول لاستخراج الصبغات من حبيبات ذات البنية النانومترية في Doryteuthis pealeii chromatophores الحبار.

Abstract

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introduction

رأسيات الأرجل مثل الحبار، الحبار، والأخطبوط لديها القدرة على تغيير مظهرها لتمويه والإشارات بشكل حيوي. ^1-6 ويدعم هذه القدرة في جزء من التوسع المساحي الانتقائي للأجهزة الصباغية المعروفة باسم chromatophores. ^4،7-9 Chromatophores هي المحركات الغازية التي تحتوي على شبكة من حبيبات الصباغ ذات البنية النانومترية محصورة ضمن كييس cytoelastic أن يرتكز شعاعيا من الألياف العضلية. ^1،3 وودفعتها أنها، chromatophores توسع بنسبة 500٪ في مساحة عرضها توزيع الحبيبات في جميع أنحاء الجهاز. ^{3،7 ، 10،11} عندما يتم منسقة هذا العمل على مدى عدد من chromatophores، يتم تغيير تلوين الشامل للحيوان. في حين أنه من المعروف أن حبيبات الصباغ تساهم في هذا التغيير اللون، لا يزال تكوينها غير معروف. نحن تصف الإجراء لعزل وتنقية أصباغ صبغية التي يمكن تكييفها للدراسات التركيبية في المستقبل.

SS = "jove_content"> عزلة حبيبات الصباغ ينطوي على استخراج متعددة الخطوات، التجانس، وإجراء تنقية. تحصد ^3،12 صبغية تحتوي على الأنسجة من خلال استئصال حذرا من الرخويات. ثم يتم استخدام عملية الهضم والتجانس لفصل الأنسجة المحيطة بها، وفصل خلايا صبغية. حبيبات ذات البنية النانومترية ثم يتم معزولة وتنقيته من chromatophores المتبقية باستخدام صوتنة المتكررة والطرد المركزي. على تنقية، يتم استخراج الصبغات من حبيبات في العملية التي يتم تكييفها من استخراج اللون مرئية من أجنحة فراشة باستخدام حلول الميثانول الحمضية. وتستخدم ¹³ الضوئي المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والقياس الطيفي للتأكد من أن الصبغات صبغية يتم استخراج بنجاح باستخدام هذه العملية.

يصف هذا الأسلوب عزلة حبيبات صبغية الذي يستخدم لاستكشاف المساهمات الجزيئية لجoloration في رأسيات الأرجل. ¹² الاستخراج جزيء صغير من الحيوانات كلها وغالبا ما يكون عملية طويلة وشاقة. والهدف هنا هو إطلاع الباحثين في المستقبل من نظام فعال وسطحي لشراء أصباغ من حبيبات ذات البنية النانومترية في رأسيات الأرجل.

Protocol

الدراسات على الحيوانات اللافقارية التي أجريت في هذه الوثيقة لا تنظم في الولايات المتحدة؛ لذا يتعين على اللجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي أي سلطة لإعادة النظر في هذه البروتوكولات. بدلا من هذه التي لا تندرج تحت اختصاص التنظيم في الولايات المتحدة، والكتاب نعلن هنا أن أجريت هذه الدراسات مع جهد صادق نحو الاستخدام الأخلاقي، والرعاية، والعلاج من هذه الحيوانات، والتقليل من عدد من الأفراد وهذه الجهود تتفق مع إعلان بازل والمجلس الدولي لمختبر علم الحيوان (ICLAS) المبادئ التوجيهية الأخلاقية.

1. Doryteuthis pealeii (د pealeii) تشريح

1. شراء قطع رأس الحبار د. pealeii من وزارة الموارد البحرية في المختبر البيولوجي البحري في وودز هول، MA أو من أي سوق الأسماك الطازجة. لا تستخدم العينات التي تم منزوع أو تغييرها في وقت سابق من أجل تطبيق هذا الإجراء. على وجه التحديد، وصفاءيجب أن يكون لا يزال طبقة tophore سليمة على عينة.
   1. إذا لم يتم استخدام الحيوانات فورا، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. محاولة لكسر جمود العينات، ووضعها في الماء درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة قبل تشريح.
2. باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ على التوالي مقص تشريح غرامة نقطة، وقطع على طول الجانب الخلفي من الحيوان. تبدأ في قاعدة عباءة بطني، وينتهي عند منطقة الزعانف.
3. إزالة كافة الأعضاء الداخلية (المعدة، الخيشومية، غدة الحبر، والأعضاء التناسلية والقلب النظامية، والقلب العضدية) التي رفعها مع تشريح ملقط وقطع أنسجتهم الضام باستخدام مقص تشريح. تجاهل أجهزة في كيس العينة.
4. استخدام تشريح T-دبابيس لدبوس عباءة (الجانب زعنفة متابعة) في معيار 11-1 / 2 "س 7-1 / 2" س 1-1 / 2 "الألومنيوم تشريح عموم تحتوي على لوحة تشريح مرنة. يغرق في الأنسجة 250 مل من مياه البحر التي تم تصفيتها من خلال نظام الترشيح فراغ البوليسترين القابل للتصرفتحتوي على 0.2 ميكرومتر أحجام المسام.
5. بعناية إزالة طبقة البشرة الجلد (لون معتم) مع ملقط تشريح، والحفاظ على صبغية تحتوي على طبقة الجلد سليمة. وبمجرد إزالة طبقة البشرة، تخلص منه في كيس العينة.
6. تشريح صغيرة (1 سم × 1 سم) أجزاء من طبقة صبغية مع ملقط ومقص تشريح. جمع العينات في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة (ملء نصف واحد من كل أنبوب فارغ مع تشريح الأنسجة).
7. إضافة 500 ميكرولتر من مياه البحر التي تمت تصفيتها إلى الأنسجة التي تحتوي على أنابيب. العينات يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

2. عزل صبغية صبغات حبيبات

1. الأنسجة الهضم
   1. إعداد غراء / كولاجيناز
      1. تزن من 30 ملغ من كولاجيناز و 5 ملغ من غراء باستخدام 4 "× 4" النيتروجين انخفاض وزن الورق. نقل هذه إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي البولي بروبيلين مع غطاء المسمار.
      2. قياس 10 مل من deionizإد المياه باستخدام ماصة تخرج. مباشرة إضافة إلى قارورة تحتوي على غراء / كولاجيناز. دوامة على أعلى الإعداد حتى حل واضح.
   2. إزالة الأنسجة خارج الخلية
      1. أجهزة الطرد المركزي الأنسجة صبغية التي تم جمعها من الخطوة 1.7 لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل الطبقة العليا من مياه البحر في دلو النفايات البلاستيكية.
      2. إضافة 500 ميكرولتر من محلول غراء / كولاجيناز إلى الأنسجة باستخدام P1000 حجم متغير قناة واحدة micropipette. دوامة كل عينة لمدة 1-2 دقائق على أعلى الإعداد.
      3. يصوتن العينات لمدة 5 دقائق على تردد 40 كيلوهرتز إلى فصل الخلايا من الأنسجة المحيطة بها.
      4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية.
      5. أجهزة الطرد المركزي الأنسجة صبغية التي تم جمعها لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل الطبقة العليا من مياه البحر في دلو النفايات البلاستيكية. أكرر مرة أخرى.
      6. يدويا إزالة أي ثانية الأنسجة كبير المتبقيةستعقد التي لم تهضم في هذه العملية مع ملقط قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
2. عزل صبغات حبيبات
   1. إعداد التجانس العازلة
      1. تزن 2.38 غرام من (4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES، 100 مم)، 0.095 غرام من كلوريد المغنيسيوم (10 ملم)، 0.856 غرام من البوتاسيوم اسبارتاتي (50 ملم)، و0.015 غرام من dithiothreitol (1 ملم). نقل إلى وعاء البوليسترين 150 مل مع غطاء المسمار. إضافة واحد تجاري لوحي مصغر مثبط البروتياز.
      2. قياس 100 مل من الماء منزوع الأيونات باستخدام الاسطوانة. مباشرة إضافة إلى الحاوية التي تحتوي على أملاح التجانس. دوامة حتى حل واضح.
   2. تجانس حبيبات الصباغ
      1. أجهزة الطرد المركزي كل عينة من الخطوة 2.1 في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. وينبغي أن تكون هذه العينة باطلة من النسيج خارج الخلية.
      2. إضافة 500 &# 181؛ ل العازلة التجانس لكل أنبوب ودوامة لمدة 1-2 دقائق لكل منهما لمزيج دقيق العينات. يصوتن العينات لمدة 30 دقيقة (~ 40 كيلو هرتز) وتابع مع 5 دقائق من الطرد المركزي في 14000 ز س.
      3. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية، وكرر الخطوة السابقة 2-3 مرات لضمان الهضم الكامل للكييس صبغية والبروتين الحبال. وينبغي أن يتضمن الحل المتبقية طاف أصفر فاتح وبيليه أحمر اللون تحتوي على حبيبات الصباغ معزولة.

3. صبغات استخراج

1. إعداد الميثانول حمضي (حمض الهيدروكلوريك-MeOH)
   1. بعناية إضافة 25 ميكرولتر من تتركز (36،5 حتي 38٪ (ث / ث)) حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) إلى 5 مل من الميثانول (MeOH). تخزين حل حمض الهيدروكلوريك-MeOH في سقف المسمار عينة زجاج القارورة. دوامة بلطف لمزج موحد الحل.
      ملاحظة: أكثر حمضية الحل، سيتم استخراج المزيد من الصباغ خلال فاياستخراج RST.
2. استخراج الصباغ
   1. الطرد المركزي تعليق الصباغ الحبيبية (من 2.2.2) لمدة 5 دقائق في 14000 x ج وتجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية.
   2. إضافة 500 ميكرولتر من محلول حمض الهيدروكلوريك-MeOH ودوامة كل عينة ل~ 3-4 دقيقة. يصوتن العينات لمدة 10 دقيقة (~ 40 كيلو هرتز)، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 14000 ز س.
   3. باستخدام ماصة نقل، وجمع طاف في 1 درهم قارورة المسمار أعلى الزجاج. وينبغي أن يكون طاف الأحمر الداكن اللون.
   4. كرر 3.2.2 استخراج الخطوة حتى يتم استخراج أي لون آخر (~ 4-5 يغسل).
      ملاحظة: كل استخراج تسفر ~ 1.5 مل من الصباغ. بيليه عديم اللون المتبقي هو الصباغ استخراج حبيبات. ملاحظة: كل من حبيبات عديم اللون وأصباغ المستخرج يمكن تخزين في الماء عند 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

4. توصيف طوال عملية استخراج

1. مسح شركةectron المجهر
   1. صورة حبيبات (غير المتفاعل من الخطوة 2.2.1 ومن الخطوة 3.2.3-استخراج الصباغ) باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للتحقق من نقاء عملية الاستخراج.
   2. لإعداد العينات الحبيبية للتصوير، أجهزة الطرد المركزي الأول سواء حبيبات غير المتفاعل والصباغ استخراج حبيبات لمدة 5 دقائق في 14000 x ج، وتجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. اعادة تعليق هذه في 1 مل من الايثانول، وإيداع 2-3 قطرات من تعليق الحبيبية على بذرة الألومنيوم SEM باستخدام ماصة نقل.
   3. بعد تجفيف العينات بين عشية وضحاها، تفل معطف مع طلاء الذهب والبلاتين لمدة 3 دقائق لتحقيق طلاء 15 نانومتر.
   4. صورة باستخدام SEM مع باعث شوتكي وكشف الإلكترون الثانوية. استخدام 5-7 كيلو فولت شعاع الجهد والعمل لمسافات ما بين 8 و 9 ملم الى صورة هذه المواد.
2. الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية تجاه) القياسات الطيفية
   1. مراقبة الامتصاصية المواليةملفات لجميع الظروف 3 (الحبيبية غير المتفاعل من 2.2.2، الصباغ المستخرج من 3.2.3، والصباغ استخراج حبيبات من 3.2.4) باستخدام شعاع الطيف الضوئي المزدوج 200-800 نانومتر.
   2. جمع قياس فارغة باستخدام الماء منزوع الأيونات في كوفيت 1 مل لحبيبات غير المتفاعل والصباغ استخراج حبيبات. جمع أشعة فوق البنفسجية فيس أطياف الامتصاص للعينات.
   3. جمع قياس فارغة باستخدام محلول الميثانول الحمضية في كوفيت 1 مل لالصباغ المستخرج. جمع أشعة فوق البنفسجية فيس طيف الامتصاص للعينة.
   4. تحديد الحد الأقصى الطول الموجي من كل عينة عن طريق تحديد الطول الموجي الذي ذروة الامتصاصية يصل أقصى ارتفاع لها النسبي.

النتائج

يتم تشريح Chromatophores من د. pealeii ظهري عباءة (الشكل 1A، 1B). مرة واحدة يتم إزالتها، وهي lysed chromatophores وتنقيتها باستخدام الطرد المركزي وغسل دورات لعزل من الحبيبات الصباغية (أرقام 2A، 2B). وتستخدم حلول الميثانول الحمضية (حم...

Discussion

لقد أثبتت طريقة لاستخراج الصبغات من حبيبات صبغية الحبار. التي تستهدف على وجه التحديد الحبيبات، وهدفنا هو تحديد دورها في التوسط تلوين التكيف. يختلف هذا الأسلوب من التقارير السابقة تهدف إلى تميز أصباغ رأسيات الأرجل باستخدام عينات الأنسجة السائبة ¹⁴ أو تجميد المج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant