Un procédé d&#39;extraction Pigments de Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Résumé

Un protocole pour l'extraction de pigments à partir des granulés nanostructurés dans squid Doryteuthis pealeii chromatophores est présenté.

Résumé

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introduction

Céphalopodes tels que les calmars, seiches, poulpes et ont la capacité de modifier dynamiquement leur apparence pour le camouflage et la signalisation. ^1-6 Cette capacité est prise en charge en partie par l'expansion zonale sélective des organes pigmentées appelées chromatophores. ^4,7-9 Chromatophores sont actionneurs souples qui contiennent un réseau de granulés de pigment nanostructurés confinés dans un saccule cytoelastic qui est ancrée radialement par des fibres musculaires. ^1,3 Comme ils sont actionnés, étendent des chromatophores de 500% dans la surface présentée à distribuer les granulés à travers l'organe. ^{3,7- , 10,11} Lorsque cette action est concertée sur un certain nombre de chromatophores, la coloration générale de l'animal est changé. Bien qu'il soit connu que les granulés de pigment contribuent à ce changement de couleur, leur composition reste inconnue. Nous décrivons une procédure pour isoler et purifier des pigments chromatophores qui peuvent être adaptés pour les futures études de composition.

L'isolement des granules pigmentaires implique une extraction en plusieurs étapes, l' homogénéisation et la procédure de purification. ^3,12 Chromatophore tissu contenant est récolté par l' extirpation attention du céphalopode. Un procédé de digestion et de l'homogénéisation est ensuite utilisée pour dissocier le tissu environnant et séparer les cellules chromatophores. Les granulés nanostructurés sont ensuite isolés et purifiés à partir des chromatophores restantes en utilisant la sonication et centrifugation répétée. Après purification, les pigments sont extraits des granules dans un processus qui est adapté de l'extraction de couleur visible à partir des ailes de papillon en utilisant des solutions de méthanol acides. Microscopie électronique ¹³ à balayage (MEB) et spectrophotométrie sont utilisés pour confirmer que les pigments de chromatophores sont extraits avec succès en utilisant ce processus.

Cette méthode décrit l'isolement des granulés de chromatophores qui est utilisé pour explorer la contribution moléculaire à coloration dans les céphalopodes. ¹² petites extractions de molécules provenant d' animaux entiers peuvent souvent être un processus long et fastidieux. Le but ici est d'informer les futurs chercheurs d'un protocole efficace et facile pour l'acquisition de pigments des granules nanostructurés en céphalopodes.

Protocole

études sur les animaux invertébrés effectuées ici ne sont pas réglementés aux États-Unis; par conséquent, le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux n'a aucune autorité pour l'examen de ces protocoles. Au lieu de ceux-ci ne relevant de la compétence de la réglementation aux États-Unis, les auteurs, par les présentes affirment que ces études ont été menées avec un effort sincère envers l'utilisation éthique, les soins et le traitement de ces animaux, le nombre de personnes a été réduit au minimum et ces efforts sont conformes à la Déclaration de Bâle et le Conseil international pour l'expérimentation animale (ICLAS) Lignes directrices en matière d'éthique.

1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection

1. Achat calmar décapité D. pealeii du Département des ressources marines au Laboratoire de biologie marine de Woods Hole, MA ou d'un marché du poisson frais. Ne pas utiliser des échantillons qui ont été filetés ou préalablement modifiés afin d'appliquer cette procédure. Plus précisément, la chromiecouche tophore doit encore être intact sur le spécimen.
   1. Si les animaux ne sont pas utilisés immédiatement, les entreposer à -20 ° C jusqu'à utilisation. Pour décongeler les spécimens, placez-les dans de l'eau à température ambiante pendant 1 heure avant la dissection.
2. Utilisation en acier inoxydable droites ciseaux de dissection pointes fines, coupées le long de la face postérieure de l'animal. Commencez à la base du manteau ventral, et se terminera à la région fin.
3. Retirez tous les organes internes (estomac, des branchies, des glandes d'encre, les organes reproducteurs, le cœur systémique, et le cœur brachial) en les soulevant avec pince à disséquer et à rompre leur tissu conjonctif à l'aide des ciseaux de dissection. Jeter les organes dans un sac de spécimen.
4. Utilisez disséquant T-broches à la broche du manteau (côté fin vers le haut) dans une norme 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan aluminium dissection contenant un tampon de dissection flexible. Immerger le tissu 250 ml d'eau de mer qui a été filtrée à travers un système de filtration sous vide en polystyrène à usage uniquecontenant 0,2 um taille des pores.
5. Retirez délicatement la couche de peau épidermique (couleur opaque) avec une pince à disséquer, en gardant la couche de peau de chromatophores contenant intact. Une fois que la couche de l'épiderme est éliminé, le jeter dans un sac à échantillon.
6. Disséquer petits (1 cm x 1 cm) sections de la couche de chromatophores avec des pinces et des ciseaux de dissection. Prélever des échantillons dans des tubes de 1,5 ml de micro-centrifugeuse (remplir la moitié de chaque tube vide avec le tissu disséqué).
7. Ajouter 500 ul d'eau de mer filtrée au tissu contenant des tubes. Les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit à 4 ° C.

2. Isolating Chromatophore Pigment Granules

1. La digestion du tissu
   1. Préparation de la papaïne / collagénase
      1. Peser 30 mg de collagénase et 5 mg de papaïne en utilisant un "x 4" faible teneur en azote 4 peser papier. Transférer ces derniers dans un polypropylène tube de centrifugeuse de 50 ml avec un bouchon à vis.
      2. Mesurer 10 ml de deionizl'eau ed l'aide d'une pipette graduée. Ajouter directement au flacon contenant de la papaïne / collagénase. Vortex sur le réglage le plus élevé jusqu'à ce que la solution soit limpide.
   2. Retrait de tissus extracellulaires
      1. Centrifuger le tissu collecté de l'étape chromatophores 1,7 pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter la couche supérieure de l'eau de mer dans un seau de déchets plastiques.
      2. Ajouter 500 ul de la solution de papaïne / collagénase dans le tissu en utilisant un volume variable P1000 canal unique micropipette. Vortex chaque échantillon pendant 1-2 min sur le réglage le plus élevé.
      3. Soniquer les échantillons pendant 5 minutes à une fréquence de 40 kHz à se dissocier des cellules provenant du tissu environnant.
      4. Centrifuger pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques.
      5. Centrifuger le tissu collecté chromatophores pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter la couche supérieure de l'eau de mer dans un seau de déchets plastiques. Répéter encore une fois.
      6. Supprimez manuellement tout en restant un grand sec de tissutions qui ne digèrent dans ce processus avec une pince avant de passer à l'étape suivante.
2. Isoler le Pigment Granules
   1. Préparation de Homogénéisation Buffer
      1. Peser 2,38 g de (4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de chlorure de magnésium (10 mM), 0,856 g de potassium-aspartate (50 mM) et 0,015 g de dithiothréitol (1 mM). Transférer dans un récipient en polystyrène de 150 ml avec un bouchon à vis. Ajouter une mini-comprimé inhibiteur de protéase commerciale.
      2. Mesurer 100 ml d'eau déminéralisée à l'aide d'une éprouvette graduée. Ajouter directement dans le récipient contenant les sels d'homogénéisation. Vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
   2. Homogénéisation de Granules pigmentaires
      1. Centrifuger chaque échantillon de l'étape 2.1 à 14000 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. Cet échantillon doit être vide de tissu extracellulaire.
      2. Ajouter 500 &# 181; l de tampon d'homogénéisation dans chaque tube et vortexer pendant 1 à 2 min chacun pour bien mélanger les échantillons. Soniquer les échantillons pendant 30 min (~ 40 kHz) et de suivre avec 5 min de centrifugation à 14000 x g.
      3. Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques, et répétez l'étape précédente 2-3 fois afin d'assurer la digestion complète des chromatophores sacculus et de protéines longes. La solution restante doit contenir un surnageant jaune clair et une pastille de couleur rouge contenant les granules pigmentaires isolés.

3. Pigment Extraction

1. Préparation du méthanol acide (HCl-MeOH)
   1. ajouter avec précaution 25 pi de concentré (36,5 à 38% (p / p)) de l'acide chlorhydrique (HCl) à 5 ml de methanol (MeOH). Conserver la solution HCl-MeOH dans un bouchon à vis échantillon de verre du flacon. Agiter doucement pour mélanger uniformément la solution.
      NOTE: Plus la solution est acide, plus pigment sera extrait au cours de la fiextraction première.
2. Extraction du pigment
   1. Centrifuger la suspension de pigment de granule (de 2.2.2) pendant 5 min à 14000 xg et jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques.
   2. Ajouter 500 ul de la solution de HCl-MeOH et Vortexer chaque échantillon pendant environ 3-4 min. Soniquer les échantillons pendant 10 min (~ 40 kHz), puis centrifuger pendant 5 min à 14 000 x g.
   3. En utilisant une pipette de transfert, de recueillir le surnageant dans un flacon 1 dram vis-top en verre. Le surnageant doit être de couleur rouge foncé.
   4. Répétez la 3.2.2 étape d'extraction jusqu'à ce qu'aucun autre couleur est extrait (~ 4-5 lavages).
      NOTE: Chaque extraction donnera ~ 1,5 ml de pigment. Le culot incolore restant est le pigment extrait des granules. REMARQUE: Les deux granules incolores et des pigments extraits peuvent être stockés dans l'eau à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

4. Caractérisation tout au long du processus d'extraction

1. Numérisation ElECTRON Microscopie
   1. Les granules d'image (pas réagi provenant de l'étape 2.2.1 et un pigment extrait à l'étape 3.2.3), en utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM) pour vérifier la pureté du procédé d'extraction.
   2. Pour préparer des échantillons de granulés pour l'imagerie, première centrifugeuse à la fois des granules pigmentaires ayant pas réagi et extrait des granules pendant 5 min à 14000 xg, et jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. Resuspendre ceux-ci dans 1 ml d'éthanol et de dépôt 2-3 gouttes de la suspension de granulés ONTO moignons aluminium SEM en utilisant une pipette de transfert.
   3. Après séchage, les échantillons pendant une nuit, par pulvérisation cathodique couche de revêtement d'or-platine pendant 3 min pour obtenir un revêtement de 15 nm.
   4. L'image en utilisant un MEB avec un émetteur Schottky, et un détecteur d'électrons secondaires. Utilisez une tension de faisceau 5-7 kV et une distance de travail entre 8 et 9 mm à l'image de ces matériaux.
2. Ultraviolet-visible Mesures spectrophotométriques (UV-vis)
   1. Surveiller la pro absorbanceles fichiers pour les 3 conditions (2.2.2 granule n'a pas réagi, du pigment extrait de 3.2.3, et de pigment extrait granules à partir 3.2.4) à l'aide d'un spectrophotomètre à double faisceau 200-800 nm.
   2. Recueillir une mesure à blanc avec de l'eau déminéralisée dans une cuvette de 1 ml pour les granules ayant pas réagi et les pigments extraits granulés. Recueillir des spectres d'absorption UV-Vis pour les deux échantillons.
   3. Recueillir une mesure à blanc en utilisant la solution de méthanol acide dans une cuvette de 1 ml pour le pigment extrait. Recueillir le spectre d'absorption UV-Vis pour l'échantillon.
   4. Déterminer la longueur d'onde maximale de chaque échantillon en identifiant la longueur d'onde à laquelle le pic d'absorbance atteint sa hauteur maximale relative.

Résultats

Chromatophores sont disséqués à partir du D. pealeii dorsale manteau (Figure 1A, 1B). Une fois qu'ils sont retirés, les chromatophores sont lysées et purifiées en utilisant des cycles de centrifugation et de lavage pour isoler les granulés pigmentés (figures 2A, 2B). Des solutions de méthanol acide (HCl-MeOH) sont utilisées pour extraire le pigment à partir des granulés (figure 2C),

Discussion

Nous avons démontré une méthode pour extraire les pigments de granulés de chromatophores calmar. En ciblant spécifiquement les granules, notre objectif est de déterminer leur rôle dans la médiation de la coloration adaptative. Cette méthode diffère des précédents rapports conçus pour caractériser les pigments de céphalopodes en utilisant des échantillons de tissus en vrac ¹⁴ ou lyophilisé la peau ^15.

Bien que ce protocole est efficace pour l'extract...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant