שיטה לחילוץ פיגמנטים מן קלמארי<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Summary

פרוטוקול להפקת פיגמנטים מן גרגרי nanostructured ב כרומטופור דיונון Doryteuthis pealeii מוצג.

Abstract

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introduction

דיונונים כגון דיונון, דיונון, תמנון יש את היכולת לשנות את המראה שלהם באופן דינמי עבור הסוואה ואיתות. ^1-6 יכולת זו נתמכת בחלקה על ידי ההרחבה האזורית סלקטיבית של איברים פיגמנט המכונים כרומטופור. ^4,7-9 כרומטופור הוא ומפעילים רכים המכילים רשת של גרגרי פיגמנט nanostructured הכלוא בתוך sacculus cytoelastic מעוגנים רדיאלית ידי סיבי שריר. ^1,3 כפי שהם מופעלים, כרומטופור להרחיב ב -500% ב שטח פנים הציג הפצת גרגרי ברחבי האיברים. ^{3,7 , 10,11} כאשר פעולה זו מתואמת על פני מספר כרומטופור, הצבעוניות הכללית של החיה משתנית. אמנם ידוע כי גרגרי פיגמנט לתרום לשינוי הצבע הזה, הרכבן נותר עלום. אנו מתארים הליך לבודד ולטהר פיגמנטים כרומטופור אשר עשוי להיות מותאם ללימודי הלחנה בעתיד.

ss = "jove_content"> הבידוד של גרגרי פיגמנט כרוך מיצוי רב שלבים, המגון, הליך טיהור. ^3,12 רקמה המכילה כרומטופור נאספה באמצעות כריתה זהירה מן סילוניות. תהליך העיכול ויצירת הומוגניות מכן נעשה שימוש כדי לנתק את הרקמה שמסביב ולהפריד התאים כרומטופור. גרגרי nanostructured אז הם מבודדים מטוהרים מן כרומטופור הנותר באמצעות sonication חוזרת צנטריפוגה. לאחר טיהור, פיגמנטים המחולצים הגרגירים תהליך מותאמת החילוץ של צבע גלוי כנפי הפרפר באמצעות פתרונות מתנול חומצי. ¹³ במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו spectrophotometry משמשים כדי לאשר את הפיגמנטים כרומטופור המחולצים בהצלחה באמצעות תהליך זה.

שיטה זו מתארת ​​את הבידוד של גרגרי כרומטופור המשמש לחקור את התרומות המולקולריות גoloration ב דיונונים. ¹² עקירות מולקולה קטנה מחיות כולו לעתים קרובות יכול להיות תהליך ארוך ומייגע. המטרה כאן היא ליידע חוקרים עתידיים של פרוטוקול יעיל קליל לרכישת פיגמנטים מן הגרגרים nanostructured ב דיונונים.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים חסרי חוליות שנערכו במסמך זה אינם מוסדרים בארצות הברית; ולכן ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש אין סמכות לבדיקה של פרוטוקולים כאלה. במקום אלה לא נופלים תחת תחום השיפוט של רגולציה בארצות הברית, בזאת המחברים קובעים כי המחקרים הללו נערכו עם מאמץ כנה כלפי השימוש האתי, טיפול, וטיפול של בעלי חיים אלה, את מספר האנשים היה ממוזער ומאמצים אלה עולה בקנה אחד עם הנחיות אתיקת הכרזת המועצה הבינלאומית באזל למדע בעלי חי מעבדה (ICLAS).

1. pealeii Doryteuthis (ד pealeii) Dissection

1. דיונון הרכישה הערוף ד pealeii ממח' המשאבים הימיים במעבדה לביולוגיה הימית בוודס הול, MA או מכל שוק דגים טריים. אין להשתמש דגימות כי כבר שפרוסות או שינה קודמים כדי שתוכל להחיל הליך זה. באופן ספציפי, chromaשכבת tophore עדיין חייבת להיות ללא שינוי על הדגימה.
   1. אם בעלי החיים אינם משמשים מיד, לאחסן אותם ב -20 ° C עד השימוש. כדי להפשיר את דגימות, למקם אותם במים בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 לפני לנתיחה.
2. בעזרת מספריים לנתיחה קנס נקודות ישר נירוסטה, לחתוך לאורך הצד האחורי של החיה. בגין בבסיס מעטפת הגחון, ולסיים ב באזור הסנפיר.
3. הסר את כל האיברים הפנימיים (בטן, זימים, בלוטת דיו, אברי רבייה, לב מערכתי, ולב זרוע) על ידי הרמה אותם עם לנתח מלקחי ניתוק רקמת החיבור שלהם באמצעות מספריים לנתיחה. בטל איברים בתוך שקית דגימה.
4. השתמש לנתח T-סיכות להצמיד המעטפת (צד סנפיר למעלה) בתוך 2 תקן 11-1 / "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "פאן לנתיחה אלומיניום המכיל כרית לנתיחה גמישה. להטביע את הרקמה 250 מיליליטר של מי ים כי סונן דרך מערכת סינון ואקום קלקר חד פעמיהמכיל גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר.
5. מוציאים בזהירות את שכבת העור אפידרמיס (צבע אטום) עם מלקחיים לנתח, משאיר את שכבת העור המכיל כרומטופור ללא פגע. לאחר שכבת אפידרמיס מוסר, וזורק אותו בשקית דגימה.
6. לנתח קטן (1 ס"מ x 1 ס"מ) סעיפים של השכבה כרומטופור עם מלקחיים ומספריים דיסקציה. לאסוף דגימות ב 1.5 מ"ל צינורות מיקרו צנטריפוגות (למלא מחצית צינור אחד ריק עם הרקמה גזור).
7. הוסף 500 μl של מי ים מסונן אל הרקמה המכילה צינורות. הדגימות ניתן לאחסן לילה בשעה 4 ° C..

2. בידוד כרומטופור גרגרי פיגמנט

1. עיכול רקמות
   1. הכנת Papain / collagenase
      1. תשקול 30 מ"ג של collagenase ו -5 מ"ג פפאין באמצעות חנקן 4 "x 4" נמוך לשקול נייר. העבר אלה לתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל עם ראש מתברג.
      2. מדוד 10 מ"ל של deionizמי ed בעזרת פיפטה בוגרת. להוסיף ישירות בקבוקון המכיל פפאין / collagenase. וורטקס על ההגדרה הגבוהה ביותר עד הפתרון הוא ברור.
   2. הסרת רקמות תאיות
      1. צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו צעד 1.7 במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק.
      2. הוסף 500 μl של פתרון פפאין / collagenase אל הרקמה באמצעות micropipette ערוץ יחיד משתנה נפח P1000. וורטקס כל מדגם למשך 1-2 דקות על ההגדרה הגבוהה ביותר.
      3. Sonicate את הדגימות למשך 5 דקות בתדירות של 40 kHz לנתק תאים מן הרקמה הסובבת.
      4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 14,000 x. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק.
      5. צנטריפוגה רקמת כרומטופור שנאספו במשך 5 דקות ב 14,000 x ז. מחק את השכבה העליונה של מי ים לתוך דלי פסולת פלסטיק. חזור שוב.
      6. הסרה ידנית כל שניות רקמה גדולות הנותרותמשא שלא לעכל בתהליך זה עם מלקחיים לפני שתמשיך לשלב הבא.
2. בידוד גרגרי פיגמנט
   1. הכנת מאגר המגון
      1. לשקול 2.38 גר '(4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 מ"מ), 0.095 גרם של מגנזיום כלוריד (10 מ"מ), 0.856 גרם של-אספרטט אשלגן (50 מ"מ), ו 0.015 גרם של dithiothreitol (1 מ"מ). העבר לתוך מיכל קלקר 150 מ"ל עם ראש מתברג. להוסיף אחד מעכב פרוטאז Tablet מיני מסחרי.
      2. מדוד 100 מ"ל מים ללא יונים באמצעות גליל סיים. להוסיף ישירות מיכל המכיל מלחי המגון. וורטקס עד הפתרון הוא ברור.
   2. המגון של גרגרי פיגמנט
      1. צנטריפוגה מדגם משלב 2.1 ב 14,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק. מדגם זה אמור להיות ריק רקמת תאי.
      2. הוספת 500 &# 181; l של חיץ homogenization כדי צינור כל מערבולת במשך 1-2 דקות כל אחד לערבב את הדגימות ביסודיות. Sonicate את הדגימות למשך 30 דקות (~ 40 kHz) ופעל עם 5 דקות של צנטריפוגה ב 14,000 x ז.
      3. בטל supernatant לתוך דלי פסולת פלסטיק, חזור על השלב הקודם 2-3 פעמים כדי להבטיח את העיכול המלא של רצועות sacculus וחלבון כרומטופור. הפתרון הנותר צריך להכיל supernatant אור צהובה גלולה אדומה בצבע המכיל את גרגרי פיגמנט מבודדים.

3. הפקת פיגמנט

1. הכנת מתנול חומציים (HCl-MeOH)
   1. בזהירות להוסיף 25 μl של מרוכז (36.5-38% (w / w)) חומצה הידרוכלורית (HCl) עד 5 מ"ל של מתנול (MeOH). אחסן את הפתרון HCl-MeOH בבקבוקון מדגם זכוכית מתברג. מערבולת בעדינות לתערובת הפתרון באופן אחיד.
      הערה: ככל חומצי הפתרון, הפיגמנט יותר יחולצו במהלך fiחילוץ ראשון.
2. הפקת פיגמנט
   1. צנטריפוגה ההשעיה גרגר פיגמנט (מ 2.2.2) במשך 5 דקות ב 14,000 XG וזורקים supernatant לדלי פסולת פלסטיק.
   2. הוסף 500 μl של פתרון HCl-MeOH מערבולת מדגם עבור ~ 3-4 דקות. Sonicate את הדגימות למשך 10 דקות (~ 40 kHz), ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 14,000 x.
   3. בעזרת פיפטה העברה, לאסוף את supernatant בבקבוקון זכוכית 1 DRAM הברגה. את supernatant צריך להיות אדום כהה.
   4. חזור על 3.2.2 מיצוי שלב עד אין צבע נוסף מופק (~ 4-5 שוטף).
      הערה: כל חילוץ יניב ~ 1.5 מיליליטר של פיגמנט. הגלולה חסרת הצבע שנותרת היא גרגרי חילוץ פיגמנט. הערה: שני גרגרי צבע ופיגמנטים שחולצו ניתן לאחסן מים ב 4 ° C עד לשימוש נוסף.

4. אפיון לאורך תהליך החילוץ

1. El סריקהמיקרוסקופי ectron
   1. גרגרי לתמונה (unreacted משלב 2.2.1 ו-חילוץ פיגמנט משלב 3.2.3) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאמת את הטוהר של תהליך החילוץ.
   2. כדי להכין דוגמאות גרגיר הדמיה, צנטריפוגה הראשונה הוא גרגרי unreacted וגרגרי חילוץ פיגמנט במשך 5 דקות ב 14,000 XG, וזורקי supernatant לדלי פסולת פלסטיק. Re- להשעות אלה ב 1 מ"ל של אתנול, והפקדת 2-3 טיפות של השעיה גרגיר על הספחים SEM אלומיניום בעזרת פיפטה ההעברה.
   3. לאחר ייבוש דגימות לילה, גמגום מעיל עם ציפוי זהב-פלטינה במשך 3 דקות כדי להשיג ציפוי 15 ננומטר.
   4. תמונה באמצעות SEM עם פולט שוטקי וגלאי אלקטרונים משניים. השתמש מתח קורה 5-7 ק ו ו מרחק עבודה בין 8 ו -9 מ"מ לתמונת חומרים אלה.
2. Ultraviolet-גלוי (UV-VIS) מדידות spectrophotometric
   1. לפקח על פרו ספיגתקבצים עבור כל 3 התנאים (גרגיר unreacted מן 2.2.2, פיגמנט מופק 3.2.3, וגרגרי חילוץ פיגמנט מ 3.2.4) באמצעות ספקטרופוטומטר קרן כפול מ 200-800 ננומטר.
   2. אסוף מדידה ריק באמצעות מים ללא יונים ב קובט 1 מ"ל עבור גרגרי unreacted ואת גרגרי חילוץ פיגמנט. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis הן דוגמאות.
   3. אסוף מדידה ריק באמצעות פתרון מתנול חומצי קובט 1 מ"ל עבור הפיגמנט חילוץ. אסוף ספקטרום ספיגת UV-Vis למדגם.
   4. לקבוע אורך גל מרבי של כל דגימה על ידי זיהוי את אורך הגל שבו השיא הספיג מגיע לגובה ביחס המקסימלית שלה.

תוצאות

כרומטופור הוא גזור מן ד המעטפת הגבי pealeii (איור 1A, 1B). ברגע שהם מוסרים, כרומטופור הם lysed ו מטוהרים באמצעות מחזורים צנטריפוגה ושטיפת לבודד את גרגרי פיגמנט (איורים 2A, 2B). פתרונות מתנול חומציים (HCl-MeOH) משמשים כדי...

Discussion

אנחנו הוכחנו שיטה לחלץ פיגמנטים מתוך גרגרי כרומטופור דיונון. על ידי מיקוד הגרגרים במיוחד, המטרה שלנו היא לקבוע את תפקידם לתווך צבע אדפטיבית. שיטה זו בשונה מדוחות קודמים נועד לאפיין פיגמנטים סילוניות באמצעות דגימות רקמה בתפזורת ¹⁴ או מיובש בהקפאה העור ^15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant