Squid pigmentlerin çıkarılması için bir yöntem<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Özet

Kalamar Doryteuthis pealeii kromatoforlardaki nano yapılı granüllerden pigmentlerin çıkarılması için bir protokol verilmektedir.

Özet

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Giriş

Bu tür kalamar, mürekkepbalığı ve ahtapot gibi kafadan bacaklılar dinamik kamufle ve sinyalizasyon için kendi görünümünü değiştirmek için yeteneği var. ^1-6 Bu özellik kromatoforların olarak bilinen pigmentli organların seçici alansal genişleme kısmen destekleniyor. ^4,7-9 kromatoforların vardır onlar harekete geçirilir gibi kas lifleri tarafından radyal demirlemiş bir cytoelastic sacculus içinde sınırlı nano yapılı pigment granüllerinin bir ağ ihtiva yumuşak aktüatörler. ^1,3, kromatoforlar organı boyunca granülleri dağıtmak sunulan yüzey alanı% 500 genişletin. ^3,7 Bu işlem, kromatoforların bir dizi üzerinden birbiriyle uyumlu ^{olduğunda, 10,11,} hayvanın genel rengi değiştirilir. Bu pigment granülleri bu renk değişikliğine neden olduğu bilinmekle birlikte, bunların bileşimi bilinmemektedir. Bu izole edilmesi ve gelecekteki kompozisyon çalışmalar için uyarlanabilir chromatophore pigmentler saflaştırmak için bir prosedür açıklanmaktadır.

pigment granüllerinin izolasyon multistep çıkarma, homojenizasyon ve arıtma işlemini içerir. ^3,12 chromatophore içeren doku kafadanbacaklı itibaren dikkatli çıkarıldıktan ile hasat edilir. Bir sindirim ve homojenizasyon işlem daha sonra chromatophore hücreleri çevreleyen doku ayırmak ve ayırmak için kullanılır. nano yapılı granüller tekrar sonifikasyon ve santrifüjlemeden kullanılarak geri kalan kromatoforların den daha sonra izole edilir ve saflaştırılır. Saflaştırma üzerine, pigmentler, asidik metanol solüsyonları kullanılarak kelebek kanatları görünür renk ekstre uyarlanmış olan bir işlemde granüller elde edilir. ¹³ tarama elektron mikroskobu (SEM) ve spektrofotometri chromatophore pigmentler kullanarak başarılı şekilde ekstre onaylamak için kullanılan bu süreç.

Bu yöntem, C moleküler katılım keşfetmek için kullanılan chromatophore granüller izolasyonunu anlatmaktadıroloration Kafadanbacaklılarda içinde. Bütün hayvanlardan ¹² Küçük molekül ekstraksiyon genellikle uzun ve sıkıcı bir süreç olabilir. Buradaki amaç Kafadanbacaklılarda içinde nanoyapılı granüllerden pigmentlerin edinimi için etkili ve kolay protokolün gelecek araştırmacıları bilgilendirmektir.

Protokol

Amerika Birleşik Devletleri'nde düzenlenmiş değildir, burada yapılan omurgasız hayvan çalışmaları; Bu nedenle Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, protokollerin incelenmesi için yetkisi yoktur. Bu ABD'de düzenlemenin yetki alanına giren değil yerine, yazarlar burada bu çalışmalar samimi etik kullanımı konusunda çaba, özen ve bu hayvanların tedavi, birey sayısı minimize edilmiş ve bu çabaların ile yapılmıştır devlet olduğunu Basel Bildirgesi ve Laboratuar Hayvan Uluslararası Bilim Konseyi (ICLAS) etik kurallarına uyum içindedir.

1. Doryteuthis pealeii (D pealeii) Diseksiyon

1. Satın alma decapitated kalamar D. Woods Hole, MA Marine Biological Laboratory at Deniz Kaynakları Bölümü veya herhangi bir taze balık pazarından pealeii. yuvarlanabilir veya daha önce bu prosedürü uygulamak için değiştirilmiş olan örnekleri kullanmayın. Özellikle, kromatophore tabakası hala örnek üzerinde bozulmamış olmalıdır.
   1. Hayvanlar hemen kullanılmazsa, kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın. örnekleri defrost için, diseksiyon önce 1 saat boyunca oda sıcaklığında su koyun.
2. hayvanın arka tarafı boyunca kesilmiş paslanmaz çelik düz ince nokta diseksiyon makas, kullanma. ventral manto üssünde başlayın ve yüzgeç bölgede biter.
3. forseps diseksiyon ve diseksiyon makas kullanarak bağ dokusu kesilmesi ile kaldırarak iç organların (mide, solungaç, mürekkep bezi, üreme organları, sistemik kalp ve brakiyal kalp) tüm çıkarın. Bir örnek torbaya organları atın.
4. Standart 11-1 / 2'de (fin tarafı) manto pin T-işaretçilerine diseksiyon kullan "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "esnek bir diseksiyon pedi içeren alüminyum diseksiyon tava. doku Batmak bir tek kullanımlık polistiren vakum filtrasyon sistemi ile filtre edilmiş deniz suyu 250 ml0.2 um gözenek boyutlarına ihtiva etmektedir.
5. Dikkatle bozulmamış chromatophore içeren cilt tabakası tutarak, diseksiyon forseps ile epidermal deri tabakası (opak renk) çıkartın. epidermal tabaka kaldırıldıktan sonra, bir numune torbasına atın.
6. forseps ve diseksiyon makas ile chromatophore tabakasının küçük (1 cm x 1 cm) bölümleri parçalara ayır. 1.5 ml mikro santrifüj tüplerine numune toplamak (disseke doku ile her boş tüpün yarısını doldurun).
7. tüpler içeren dokuya süzülmüş deniz suyu 500 ul ekle. Numuneler 4 ° C'de gece boyunca saklanır.

2. Ayırma chromatophore Pigment Granül

1. Doku sindirimi
   1. Papain / kolajenaz hazırlanması
      1. Kağıt tartmak kollajenaz 30 mg ve 4 "x 4" düşük azot kullanarak papain 5 mg tartın. bir vida kapaklı 50 ml'lik bir polipropilen santrifüj tüpü içine bu aktarın.
      2. deioniz 10 ml ölçünBir dereceli pipet kullanarak ed su. papain / kollajenaz içeren flakon doğrudan ekleyin. çözelti kadar yüksek ayarda Vortex açıktır.
   2. Hücre dışı Doku Çıkarma
      1. x g 5 dakika 14,000 Aşama 1.7 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın.
      2. P1000 değişken hacimli tek kanallı mikropipet kullanarak doku papain / kollajenaz çözüm 500 ul ekleyin. En yüksek ayarda 1-2 dakika boyunca her bir örnek Vortex.
      3. çevreleyen doku hücreleri ayırmak için 40 kHz'lik bir frekansta 5 dakika boyunca numune sonikasyon.
      4. 14.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın.
      5. x g 5 dakika 14,000 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın. bir kez daha tekrarlayın.
      6. El ile kalan geniş doku sn kaldırmakBir sonraki adıma geçmeden önce forseps ile bu süreçte sindirimi yoktu leri.
2. Pigment granüller Yalıtımlı
   1. Homojenizasyon tamponu hazırlanması
      1. 2.38 g tartılır (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit) (HEPES, 100 mM), magnezyum klorür (10 mM), potasyum-aspartat 0.856 g (50 mM) 0.095 gr, 0.015 g ditiyotireitol (1 mM). bir vida kapaklı 150 ml'lik bir polistiren kap içine aktarın. Ticari bir küçük tablet proteaz önleyici.
      2. Bir dereceli silindir kullanarak, iyonu giderilmiş su, 100 ml ölçün. homojenizasyon tuzlar içeren kabın doğrudan ekleyin. çözelti kadar Vortex açıktır.
   2. Pigment Granül homojenizasyon
      1. 5 dakika boyunca 14.000 xg'de adım 2.1 her bir örnek santrifüj. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın. Bu örnek dışı doku geçersiz olmalıdır.
      2. Ekle 500# 181; 1-2 dakika her biri için her bir tüp ve vorteks homojenizasyon tamponu iyice örnekleri karıştırın. 30 dakika (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon ve 14,000 x g 'de santrifüj 5 dakika ile takip edin.
      3. Bir plastik atık kovaya supernatant atmak ve chromatophore sakkuluslar ve protein hayvan iplerini tam sindirim sağlamak için önceki adımı 2-3 kez tekrarlayın. Geri kalan çözelti, açık sarı bir süpernatan ve izole pigment granülleri içeren kırmızı renkli bir pelet içermelidir.

3. Pigment Ekstraksiyon

1. Asidik metanol preparasyonu (HCl-MeOH)
   1. Dikkatle 5 ml metanol (MeOH) konsantre (36,5-38% (w / w)), hidroklorik asit (HCI) 25 ul ekle. bir vida kapaklı bir cam numune şişesine HCl-MeOH çözeltisi saklayın. eşit çözüm karıştırmak için hafifçe döndürün.
      NOT: Daha fazla asidik çözelti, daha pigment fi sırasında çıkartılacaktırilk çıkarma.
2. Pigment Ekstraksiyon
   1. 14.000 xg'de 5 dakika boyunca (2.2.2) pigment granül süspansiyonu Santrifüj ve bir plastik atık kovaya süpernatant atın.
   2. HCl-MeOH çözeltisi 500 ul ilave edin ve 3-4 dakika ~ için her bir örnek girdap. 10 dakika boyunca (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon, daha sonra 14,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
   3. Bir transfer pipeti kullanarak, bir 1 dramlık vidalı kapaklı cam şişede supernatant toplamak. süpernatant rengi koyu kırmızı olmalıdır.
   4. başka bir renk (~ 4-5 yıkar) ekstre kadar çıkarma adımı 3.2.2 tekrarlayın.
      NOT: Her çıkarma ~ pigment 1.5 ml verecektir. Geri kalan renksiz bir pelet pigmenti ekstre granüller olup. Not: renksiz granül ve ekstre pigmentler iki sonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta su içinde saklanabilir.

Ekstraksiyon Süreci boyunca 4. Karakterizasyonu

1. Tarama ElECTRON Mikroskopi
   1. ekstraksiyon işlemi saflığını doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak (adım 2.2.1 ve pigment ekstre adım 3.2.3 dan girmemiş) Görüntü granülleri.
   2. 14.000 xg'de 5 dakika boyunca görüntüleme, ilk santrifüj hem reaksiyona girmemiş granül ve pigment çıkarılan granüller granül örnekleri hazırlamak ve bir plastik atık kovaya süpernatant atmak için. 1 ml etanol ve mevduat bir transfer pipet kullanarak alüminyum SEM taslakları üzerine granül süspansiyonu 2-3 damla bu yeniden askıya.
   3. gece boyunca örnekleri kurutulduktan sonra 15 mil bir kaplama elde etmek 3 dakika için altın, platin kaplamalı kat püskürtmeyle çökeltilmesi.
   4. Bir Schottky verici ve bir ikincil elektron dedektörü ile bir SEM ile görüntü. 5-7 kV ışını gerilim ve görüntüye 8 ve 9 mm, bu malzemeler arasında bir çalışma mesafesi kullanın.
2. Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) Spektrofotometrik Ölçümler
   1. absorbans pro Monitör200-800 nm bir çift ışın spektrofotometre kullanılarak 3 koşulları için dosyaları (2.2.2 girmemiş granül, 3.2.3 çıkarılan pigment ve 3.2.4 pigment çıkarılan granül).
   2. reaksiyona girmemiş granüller ve pigment ekstre granüller için 1 ml'lik bir küvete deiyonize su kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. Her iki numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumları toplayın.
   3. ekstre pigment için 1 ml'lik bir küvete asidik metanol çözeltisi kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumu toplayın.
   4. Soğurma tepe noktasının maksimum görece yüksekliğe ulaşır dalgaboyunu tanımlayarak Her numunenin maksimum bir dalga boyuna belirler.

Sonuçlar

Kromatoforlar D. disseke edilir pealeii dorsal manto (Şekil 1A, 1B). Bunlar kaldırıldıktan sonra, kromatoforlar lize edildi ve pigment granülleri (Şekil 2A, 2B) üzerinden izole etmek için santrifüj ve yıkama döngüleri kullanılarak saflaştırılır. Asidik metanol solüsyonları (HCl-MeOH) çözülebilir pigment özü ve çözünmeyen, renksiz bir pigment ekstre granüller hasıl granüller...

Tartışmalar

Bu kalamar chromatophore granüllerden pigmentlerin elde etmek için bir yöntem gösterilmiştir. Özellikle granülleri hedefleyerek, hedefimiz adaptif renklenmeye aracılık rollerini tespit etmektir. Bu yöntem toplu doku örnekleri ¹⁴ veya dondurularak kurutulmuş bir cilt ¹⁵ kullanılarak cephalopod pigmentler karakterize etmek için tasarlanan önceki raporlarda farklıdır.

Bu protokol, chromatophore pigmentler ekstre etkili olsa da, küçük reaksiyon ölçekle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant