Un método para extraer pigmentos de calamar<em&gt; Pealeii Doryteuthis</em

Resumen

Se presenta un protocolo para la extracción de pigmentos a partir de los gránulos nanoestructurados en Doryteuthis pealeii cromatóforos calamar.

Resumen

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introducción

Cefalópodos como el calamar, la sepia, el pulpo y tienen la capacidad de alterar su apariencia dinámica para camuflar y señalización. ^1-6 Esta capacidad es apoyado en parte por la expansión de área selectiva de órganos pigmentadas conocidas como cromatóforos. ^4,7-9 Cromatóforos son actuadores blandos que contienen una red de gránulos de pigmento nanoestructurados confinados dentro de un sáculo cytoelastic que está anclado radialmente por las fibras musculares. ^1,3 a medida que se accionan, cromatóforos expanden por 500% de la superficie presentado la distribución de los gránulos de todo el órgano. ^{3,7 10,11} Cuando esta acción es concertada a través de una serie de cromatóforos, se cambia la coloración general del animal. Aunque se sabe que los gránulos de pigmento contribuyen a este cambio de color, su composición sigue siendo desconocido. Se describe un procedimiento para aislar y purificar los pigmentos cromatóforos que pueden ser adaptados para futuros estudios de composición.

El aislamiento de gránulos de pigmento implica una extracción de múltiples etapas, homogeneización, y el procedimiento de purificación. ^3,12 chromatophore tejido que contiene se cosecha a través de la extirpación cuidado del cefalópodo. Un proceso de la digestión y la homogeneización se utiliza a continuación para disociar el tejido circundante y separar las células cromatóforos. Los gránulos nanoestructurados son entonces aislado y purificado a partir de los restantes cromatóforos utilizando sonicación y centrifugación repetidas. Tras la purificación, los pigmentos se extraen de los gránulos en un proceso que es una adaptación de la extracción de color visible de alas de mariposa usando soluciones de metanol ácidos. Microscopía electrónica ¹³ de barrido (SEM) y espectrofotometría se utilizan para confirmar que los pigmentos cromatóforos se extraen con éxito utilizando este proceso.

Este método describe el aislamiento de gránulos cromatóforos que se utiliza para explorar las contribuciones moleculares acoloration en cefalópodos. ¹² extracciones de moléculas de animales enteros a menudo puede ser un proceso largo y tedioso. El objetivo es informar a los futuros investigadores de un protocolo eficaz y fácil para la adquisición de los pigmentos de los gránulos nanoestructurados en los cefalópodos.

Protocolo

los estudios en animales invertebrados realizadas en este documento no están regulados en los Estados Unidos; Por lo tanto, el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional no tiene autoridad para la revisión de dichos protocolos. En lugar de estos no cae bajo la jurisdicción de la regulación en los Estados Unidos, los autores declaran que estos estudios fueron realizados con un esfuerzo sincero hacia el uso ético, el cuidado y el tratamiento de estos animales, se redujo al mínimo el número de individuos y estos esfuerzos son consistentes con la Declaración de Basilea y el Consejo Internacional para la Ciencia Animal de Laboratorio (ICLAS) las directrices éticas.

1. Doryteuthis pealeii (pealeii D.) La disección

1. Compra de calamar decapitado D. pealeii del Departamento de Recursos Marinos en el Laboratorio de Biología Marina en Woods Hole, MA o de cualquier mercado de pescado fresco. No utilice muestras que han sido previamente fileteados o alterados con el fin de aplicar este procedimiento. Específicamente, el cromacapa tophore todavía debe estar intacto en la muestra.
   1. Si los animales no se utilizan inmediatamente, almacenar a -20 ° C hasta su uso. Para descongelar las muestras, colocarlos en agua a temperatura ambiente durante 1 hora antes de la disección.
2. El uso de acero inoxidable tijeras de disección de punta fina rectas, cortadas a lo largo de la parte posterior del animal. Comience en la base del manto ventral, y terminará en la región de la aleta.
3. Eliminar todos los órganos internos (estómago, las branquias, glándula de tinta, órganos reproductivos, corazón sistémico, y el corazón braquial) levantándolas con pinzas de disección y la ruptura de su tejido conjuntivo con tijeras de disección. Desechar los órganos en una bolsa de muestras.
4. Utilice la disección de T-alfileres para fijar el manto (lado de las aletas hacia arriba) en un estándar de 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan disección de aluminio que contiene una almohadilla de disección flexible. Sumergir el tejido en 250 ml de agua de mar que se ha filtrado a través de un sistema de filtración a vacío desechable de poliestirenoque contiene 0,2 micras tamaños de poro.
5. Retirar con cuidado la capa epidérmica de la piel (color opaco) con pinza de disección, manteniendo intacta la capa de piel que contiene chromatophore. Una vez que se retira la capa epidérmica, desprenderse de ella en una bolsa de muestras.
6. Diseccionar pequeños (1 cm x 1 cm) de las secciones de la capa de chromatophore con unas pinzas y tijeras de disección. Recoger muestras en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (llene la mitad de cada tubo de vacío con el tejido diseccionado).
7. Añadir 500 l de agua de mar filtrada al tejido que contiene tubos. Las muestras se pueden almacenar durante la noche a 4 ° C.

2. Aislamiento de chromatophore pigmento gránulos

1. La digestión del tejido
   1. Preparación de papaína / colagenasa
      1. Pesar 30 mg de colagenasa y 5 mg de papaína utilizando una "x 4" bajo nitrógeno 4 Documento de pesar. Transferirlas a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml con tapón de rosca.
      2. Medir 10 ml de deionized agua usando una pipeta graduada. Añadir directamente al vial que contiene papaína / colagenasa. Vórtice a la máxima temperatura hasta que la solución es clara.
   2. La eliminación de tejido extracelular
      1. Centrifugar el tejido chromatophore recogido de la etapa 1.7 durante 5 minutos a 14.000 x g. Desechar la capa superior de agua de mar en un cubo de residuos plásticos.
      2. Añadir 500 l de la solución de papaína / colagenasa al tejido usando una micropipeta de volumen variable solo canal P1000. Vortex cada muestra durante 1-2 minutos en la posición más alta.
      3. Sonicar las muestras durante 5 min a una frecuencia de 40 kHz para disociar las células del tejido circundante.
      4. Centrifugar durante 5 min a 14.000 x g. Descartar el sobrenadante en un cubo de residuos plásticos.
      5. Centrifugar el tejido chromatophore recogido durante 5 min a 14.000 x g. Desechar la capa superior de agua de mar en un cubo de residuos plásticos. Repetir una vez más.
      6. quitar manualmente cualquier tejido seg gran restantelas que no digieren en este proceso con unas pinzas antes de proceder al siguiente paso.
2. El aislamiento del pigmento gránulos
   1. Preparación de tampón de homogeneización
      1. Pesar 2,38 g de (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de cloruro de magnesio (10 mM), 0,856 g de potasio-aspartato (50 mM), y 0,015 g de ditiotreitol (1 mM). Transferir a un recipiente de poliestireno 150 ml con un tapón de rosca. Añadir un inhibidor de la proteasa de mini tableta comercial.
      2. Medir 100 ml de agua desionizada usando un cilindro graduado. Añadir directamente al recipiente que contiene las sales de homogeneización. Vortex hasta que la solución es clara.
   2. La homogeneización de gránulos de pigmento
      1. Centrifugar cada muestra de la etapa 2.1 a 14.000 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante en un cubo de residuos plásticos. Esta muestra debe ser nula de tejido extracelular.
      2. Añadir 500 y# 181; l de tampón de homogeneización a cada tubo y agitar durante 1-2 minutos cada uno para mezclar bien las muestras. Sonicar las muestras para 30 min (~ 40 kHz) y seguir con 5 min de centrifugación a 14.000 x g.
      3. Descartar el sobrenadante en un cubo de residuos de plástico, y repetir el paso anterior 2-3 veces para asegurar la digestión completa de las correas de sujeción sáculo chromatophore y proteínas. La solución restante debe contener un sobrenadante de color amarillo claro y un sedimento de color rojo que contiene los gránulos de pigmento aisladas.

3. Pigmento Extracción

1. Preparación de metanol ácido (HCl-MeOH)
   1. Añadir cuidadosamente 25 l de concentrado (36,5 a 38% (w / w)) de ácido clorhídrico (HCl) a 5 ml de metanol (MeOH). Almacenar la solución de HCl-MeOH en un vial de muestra de vidrio tapón de rosca. Agitar suavemente para mezclar uniformemente la solución.
      NOTA: La más ácida la solución, la más pigmento se extrajo durante la fiextracción de primera.
2. Extracción de Pigmento
   1. Centrifugar la suspensión de gránulos de pigmento (de 2.2.2) durante 5 min a 14.000 xg y descartar el sobrenadante en un cubo de residuos de plástico.
   2. Añadir 500 l de la solución de HCl-MeOH y agitar cada muestra para ~ 3-4 min. Sonicar las muestras para 10 min (~ 40 kHz), centrifugar durante 5 min a 14.000 x g.
   3. Usando una pipeta de transferencia, recoger el sobrenadante en un vial de vidrio con tapa de rosca 1 dram. El sobrenadante debería ser de color rojo oscuro.
   4. 3.2.2 Repetir la etapa de extracción hasta que ya no se extrae el color (~ 4-5 lavados).
      NOTA: Cada extracción producirá ~ 1,5 ml de pigmento. El sedimento restante es incoloro los gránulos de pigmento extraído. NOTA: Los dos gránulos incoloros y pigmentos extraídos se pueden almacenar en agua a 4 ° C hasta su uso posterior.

4. Caracterización largo proceso de extracción

1. El Escaneoectron Microscopía
   1. La imagen de gránulos (sin reaccionar de la etapa 2.2.1 y pigmento extraído de la etapa 3.2.3) usando microscopía electrónica de barrido (SEM) para verificar la pureza del proceso de extracción.
   2. Para preparar las muestras de los gránulos para formación de imágenes, primero centrífuga tanto gránulos que no han reaccionado y los gránulos de pigmento se extrajo durante 5 minutos a 14.000 xg, y descartar el sobrenadante en un cubo de residuos de plástico. Vuelva a suspender estos en 1 ml de etanol, y depósito de 2-3 gotas de la suspensión de gránulos Onto trozos de aluminio SEM utilizando una pipeta de transferencia.
   3. Después de secar las muestras durante la noche, revestir con recubrimiento de oro-platino durante 3 minutos para lograr un revestimiento de 15 nm.
   4. Imagen utilizando un SEM con un emisor Schottky y un detector de electrones secundarios. Utilice un voltaje del haz de 5-7 kV y una distancia de trabajo entre 8 y 9 mm a imagen de estos materiales.
2. Las mediciones espectrofotométricas ultravioleta-visible (UV-VIS)
   1. Supervisar el pro absorbanciaarchivos para las 3 condiciones (gránulo sin reaccionar de 2.2.2, 3.2.3 pigmento extraído de, y pigmentos extraídos de gránulos 3.2.4) utilizando un espectrofotómetro de doble haz de 200-800 nm.
   2. Se recoge una medida en blanco usando agua desionizada en una cubeta de 1 ml para los gránulos sin reaccionar y los gránulos de pigmento extraído. Recoger los espectros de absorción UV-Vis para ambas muestras.
   3. Se recoge una medida en blanco utilizando la solución de metanol ácido en una cubeta de 1 ml para el pigmento extraído. Recoger espectro de absorción UV-Vis para la muestra.
   4. Determinar la máxima longitud de onda de cada muestra mediante la identificación de la longitud de onda a la que el pico de absorbancia alcanza su altura máxima relativa.

Resultados

Cromatóforos se disecan de la D. pealeii dorsal manto (Figura 1A, 1B). Una vez que se quitan, cromatóforos se lisan y se purificaron usando los ciclos de centrifugación y lavado para aislar los gránulos pigmentados (Figuras 2A, 2B). Soluciones de metanol ácido (HCl-MeOH) se utilizan para extraer el pigmento de los gránulos (Figura 2C), produciendo un extracto de pigmento soluble y gránulo...

Discusión

Hemos demostrado un método para extraer pigmentos de gránulos cromatóforos calamar. Al dirigirse específicamente a los gránulos, nuestro objetivo es determinar su papel en la mediación de la coloración de adaptación. Este método difiere de informes anteriores diseñados para caracterizar los pigmentos de cefalópodos usando muestras de tejido a granel ¹⁴ o liofilizado piel ^15.

Mientras que este protocolo es eficaz en la extracción de pigmentos cromatóforos, s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant