Ein Verfahren zum Extrahieren Pigmente aus Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Extraktion von Pigmenten aus den nanostrukturierten Granulat in Tintenfisch Doryteuthis pealeii Chromatophoren vorgestellt.

Zusammenfassung

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Einleitung

Kopffüßer wie Tintenfische, Tintenfische und Kraken haben die Fähigkeit, dynamisch ihr Aussehen verändern , für Tarnen und Signalisierung. ^1-6 Diese Fähigkeit durch die selektive Flächenausdehnung von pigmentierten Organe teilweise als Chromatophoren bekannt unterstützt wird. ^4,7-9 Chromatophoren Weich Aktoren , die ein Netzwerk von nanostrukturiertem Pigmentgranulaten in einem cytoelastic sacculus beschränkt enthalten , die radial von Muskelfasern verankert ist. ^1,3 Da sie betätigt werden, Chromatophoren um 500% in präsentierten Oberfläche erweitern , um die Granulate im gesamten Organ verteilen. ^{3,7 10,11,} Wenn diese Aktion über eine Anzahl von aufeinander abgestimmten Chromatophoren wird, wird die Gesamtfärbung des Tieres verändert. Während es bekannt ist, daß die Pigmentgranulate dieser Farbänderung beitragen, bleibt deren Zusammensetzung unbekannt. Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von chromatophore Pigmente, die für zukünftige Studien Zusammensetzungs angepasst werden kann.

Die Isolierung von Pigmentkörnchen beinhaltet ein mehrstufiges Extraktion, Homogenisierung und Reinigungsverfahren. ^3,12 Chromatophor haltiges Gewebe durch sorgfältige Exstirpation von der Kopffüßer geerntet wird. Eine Verdauung und Homogenisierungsverfahren wird dann verwendet, um das umgebende Gewebe zu dissoziieren und die chromatophore Zellen trennen. Die nanostrukturierten Granula werden dann isoliert und gereinigt aus den verbleibenden Chromatophoren wiederholt unter Verwendung von Beschallung und Zentrifugation. Nach der Reinigung werden Pigmente aus dem Granulat in einem Verfahren extrahiert , das aus der Gewinnung von sichtbaren Farbe aus Schmetterlingsflügeln mit saurem Methanol - Lösungen. ¹³ Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Spektrometrie werden verwendet , um zu bestätigen , dass die Chromatophoren - Pigmente erfolgreich extrahiert angepasst ist , dieser Prozess.

Diese Methode beschreibt die Isolierung von chromatophore Granulat, das verwendet wird, um die molekularen Beiträge zu c zu erkundenoloration in Kopffüßer. ¹² kleine Molekül - Extraktionen von ganzen Tieren kann oft ein langer und mühsamer Prozess sein. Das Ziel hier ist es, zukünftige Forscher einer effektiven und einfachen Protokoll für den Erwerb von Pigmenten aus den nanostrukturierten Granulat in Kopffüßer zu informieren.

Protokoll

Invertebrate Tierstudien durchgeführt, hier sind in den Vereinigten Staaten nicht geregelt; daher die Institutional Animal Care und Use Committee hat keine Befugnis zur Überprüfung solcher Protokolle. Anstelle dieser nicht unter die Zuständigkeit der Regulierung in den Vereinigten Staaten fallen, so die Autoren hiermit, dass diese Studien wurden mit aufrichtigen Bemühungen im Hinblick auf die ethische Nutzung, Pflege und Behandlung dieser Tiere durchgeführt wird, wurde die Anzahl der Individuen minimiert und diese Bemühungen mit der Basler Deklaration und des Internationalen Rates für Versuchstierkunde (ICLAS) Ethik-Richtlinien stehen im Einklang.

1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection

1. Kauf enthauptet Tintenfisch D. pealeii von der Marine Ressourcen Abteilung am Marine Biological Laboratory in Woods Hole, MA oder einer Frischfischmarkt. Verwenden Sie keine Proben, die um verrundet oder zuvor geändert wurden, um dieses Verfahren anzuwenden. Insbesondere ist die Chromatophore Schicht muss noch auf die Probe intakt sein.
   1. Wenn die Tiere nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. Um die Proben aufzutauen, legen Sie sie in Wasser bei Raumtemperatur für 1 Stunde vor der Präparation.
2. Mit Edelstahl gerade fein-Punkt-Dissektion Schere entlang der hinteren Seite des Tieres geschnitten. Beginnen an der Basis des ventralen Mantel und an dem Rippenbereich endet.
3. Entfernen Sie alle inneren Organe (Magen, Kiemen, Tinte Drüse, Fortpflanzungsorgane, systemische Herz und brachial Herz) von ihnen heben mit einer Pinzette zu sezieren und Abtrennen ihre Bindegewebe Dissektion Schere. Entsorgen Organe in einem Probenbeutel.
4. Verwenden Sie sezieren T-Pins den Mantel an Pin (fin Seite nach oben) in einem Standard-11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan Aluminium Dissektion eine flexible Präparation Pad enthält. Versenken des Gewebes in 250 ml Meerwasser, das durch eine Einweg-Polystyrol-Vakuum-Filtrationssystem gefiltert wurdeenthaltend 0,2 & mgr; m Porengrößen.
5. den epidermalen Hautschicht (Deckfarbe) mit Pinzette, die Chromatophoren haltige Hautschicht intakt bleibt vorsichtig entfernen. Sobald die epidermale Schicht entfernt wird, entsorgen Sie sie in einem Probenbeutel.
6. Präparieren klein (1 cm x 1 cm) Abschnitte der Chromatophoren-Schicht mit einer Pinzette und Schere Dissektion. Die Proben werden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (füllen die Hälfte jedes Leerrohr mit dem sezierten Gewebe).
7. Hinzufügen 500 ul gefiltertes Seewasser mit dem Gewebe enthaltenden Röhrchen. Die Proben können über Nacht bei 4 ° C gelagert werden.

2. Isolierkanne Chromatophor Pigmentgranula

1. Tissue Verdauung
   1. Herstellung von Papain / Kollagenase
      1. Man wiegt 30 mg Kollagenase und 5 mg Papain mit einem 4 "x 4" niedrigen Stickstoff wiegen Papier. Bringen Sie diese in einem 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.
      2. Messen Sie 10 ml deionized Wasser mit einer Messpipette. Fügen Sie direkt Papain / Kollagenase Fläschchen enthält. Vortex auf die höchste Einstellung, bis die Lösung klar ist.
   2. Entfernen extrazelluläre Anhäufung
      1. Zentrifugieren des gesammelten chromatophore Gewebe aus Schritt 1.7 für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie die obere Schicht aus Meerwasser in einen Kunststoffabfallbehälter.
      2. In 500 ul der Papain / Kollagenase-Lösung auf das Gewebe ein P1000 variablen Volumen Einkanal-Mikropipette. Vortex jede Probe für 1-2 Minuten auf die höchste Einstellung.
      3. Beschallen die Proben 5 min bei einer Frequenz von 40 kHz Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu trennen.
      4. Zentrifuge für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter.
      5. Zentrifugieren des gesammelten chromatophore Gewebe für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie die obere Schicht aus Meerwasser in einen Kunststoffabfallbehälter. Wiederholen Sie noch einmal.
      6. Entfernen Sie manuell alle verbleibenden großen Gewebe secgen, die in diesem Prozess mit einer Pinzette verdauen nicht vor dem nächsten Schritt fortfahren.
2. Isolieren der Pigmentkörnchen
   1. Herstellung von Homogenisierungspuffer
      1. Wiegen 2,38 g (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure) (HEPES, 100 mM), 0.095 g Magnesiumchlorid (10 mM), 0,856 g Kalium-aspartat (50 mM) und 0,015 g Dithiothreitol (1 mM). In einen 150 ml Polystyrolbehälter mit Schraubverschluss. In einer kommerziellen Mini-Tablet-Protease-Inhibitor.
      2. Messung der 100 ml entionisiertes Wasser mit einem Meßzylinder verwendet wird. Fügen Sie direkt in den Behälter, der die Homogenisierung Salze enthält. Vortex, bis die Lösung klar ist.
   2. Homogenisieren von Pigmentgranulaten
      1. Zentrifugieren jede Probe aus Schritt 2.1 bei 14000 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter. Diese Probe sollte frei von extrazellulären Gewebe sein.
      2. In 500 &# 181; l Homogenisierungspuffer in jedes Röhrchen und Vortex für 1-2 min je gründlich die Proben mischen. Beschallen die Proben für 30 Minuten (~ 40 kHz) und folgen mit 5 min Zentrifugation bei 14.000 x g.
      3. Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter, und wiederholen Sie 2-3 mal den vorherigen Schritt die vollständige Verdauung der chromatophore sacculus und Protein Anbindehaltung zu gewährleisten. Die verbleibende Lösung sollte eine hellgelbe Überstand enthalten und eine rot gefärbte Pellet die isolierten Pigmentkörnchen enthalten.

3. Pigmentextraktion

1. Herstellung von saurem Methanol (HCl-MeOH)
   1. Vorsichtig 25 ul konzentriert (36,5 bis 38% (w / w)), Salzsäure (HCl) zu 5 ml Methanol (MeOH). Lagern Sie das HCl-MeOH-Lösung in einem Schraubdeckel Glasprobenfläschchen. Vorsichtig schwenken, um die Lösung gleichmäßig mischen.
      HINWEIS: Je saurer die Lösung ist, desto mehr Pigment wird während der fi extrahiert werdenerste Extraktion.
2. Extraktion von Pigment
   1. Zentrifugieren Sie die Pigmentgranulatsuspension (von 2.2.2) für 5 min bei 14.000 xg und entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter.
   2. In 500 ul der HCl-MeOH-Lösung und Vortex jede Probe für ~ 3-4 min. Beschallen die Proben für 10 min (~ 40 kHz), dann zentrifugieren für 5 min bei 14.000 x g.
   3. Mit Hilfe einer Transferpipette, sammeln Sie den Überstand in einer 1-Dram-Schraubdeckel-Glasfläschchen. Der Überstand sollte in der Farbe dunkelrot sein.
   4. Wiederholen Sie den Extraktionsschritt 3.2.2 bis keine weitere Farbe extrahiert (~ 4-5 Wäschen).
      HINWEIS: Jede Extraktion wird ~ 1,5 ml Pigment ergeben. Das verbleibende farblose Pellet wird das Pigment extrahierte Granulat. Hinweis: beide farblos Granulat und extrahiert Pigmente können in Wasser bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

4. Charakterisierung gesamten Extraktionsverfahren

1. Scannen Electron Mikroskopie
   1. Bild das Granulat (nicht umgesetztes aus Schritt 2.2.1 und pigment extrahiert aus Schritt 3.2.3) unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), um die Reinheit des Extraktionsprozesses zu überprüfen.
   2. Um Granulatproben für die Bildgebung, erste Zentrifuge beide nicht umgesetzten Granulat und Pigment extrahiert Granulat für 5 min bei 14.000 · g, und entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter herzustellen. Re-suspendieren diese in 1 ml Ethanol und Ablagerung 2-3 Tropfen der Granulatsuspension auf Aluminium SEM Stubs eine Transferpipette.
   3. über Nacht, nachdem die Proben trocknen, Sputter-Mantel mit Gold-Platin-Beschichtung für 3 min eine 15 nm Beschichtung zu erreichen.
   4. Bild unter Verwendung eines SEM mit einer Schottky-Emitter und einem Sekundärelektronendetektor. Verwenden Sie einen 5-7 kV Strahlspannung und einen Arbeitsabstand zwischen 8 und 9 mm Bild diese Materialien.
2. UV-VIS (UV-vis) spektrophotometrische Messungen
   1. Überwachen Sie die Absorption proDateien für alle drei Bedingungen (nicht umgesetztes Granulat aus 2.2.2, extrahiert Pigment aus 3.2.3 und Pigment extrahiert Granulat aus 3.2.4) mit einem Doppelstrahl-Spektrophotometer 200-800 nm verwendet wird.
   2. Sammeln Sie eine Leermessung VE-Wasser in einer 1-ml-Küvette für den nicht umgesetzten Granulat und das Pigment extrahiert Granulat verwendet wird. Sammeln Sie UV-Vis-Absorptionsspektren für beide Proben.
   3. Sammeln Sie eine leere Messung der sauren Methanollösung in einer 1-ml-Küvette für das extrahierte Pigment verwendet wird. Sammeln Sie UV-Vis-Absorptionsspektrum für die Probe.
   4. Bestimmen maximale Wellenlänge jeder Probe durch die Wellenlänge identifiziert, an dem die Absorptionsspitze ihre maximale relative Höhe erreicht.

Ergebnisse

Chromatophoren werden aus dem D. seziert pealeii dorsal Mantel (1A, 1B). Sobald sie entfernt werden, werden Chromatophoren lysiert und gereinigt Zyklen Zentrifugation und Waschen der pigmentierten Granulate (2A, 2B) zu isolieren geführt. Sauren Methanollösungen (HCl-MeOH) werden verwendet , um das Pigment aus dem Granulat (2C) zu extrahieren, um ein lösliches Pigment Extrakt und unl?...

Diskussion

Wir haben ein Verfahren zum Extrahieren von Pigmenten squid chromatophore Granulat demonstriert. Durch speziell auf die Granulat-Targeting, unser Ziel ist es, ihre Rolle bei der Vermittlung der adaptive Färbung zu bestimmen. Diese Methode unterscheidet sich von früheren Berichten entworfen Kopffüßer Pigmente mit Bulk - Gewebeproben ¹⁴ oder gefriergetrocknet Haut ¹⁵ zu charakterisieren.

Während dieses Protokolls auf Extrahieren chromatophore Pigmente wirksam ist, wi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant