Um método para extrair Pigmentos de Squid<em&gt; Pealeii Doryteuthis</em

Resumo

Um protocolo para a extração de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em lulas Doryteuthis pealeii cromatóforos é apresentado.

Resumo

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introdução

Cefalópodes, tais como lulas, chocos, polvo e tem a capacidade de alterar dinamicamente a sua aparência para camuflar e sinalização. ^1-6 Esta capacidade é apoiado em parte pela expansão de área seletiva de órgãos pigmentadas conhecidos como cromatóforos. ^4,7-9 Cromatóforos são actuadores macias que contêm uma rede de grânulos de pigmento nanoestruturados confinados dentro de uma sáculo cytoelastic que está ancorado radialmente por fibras musculares. ^1,3 Como eles são actuados, chromatophores expandir por 500% da área de superfície apresentada a distribuição dos grânulos durante todo o órgão. ^{3,7 , 10,11} Quando esta acção concertada ao longo de um número de chromatophores, a coloração geral do animal é alterada. Embora se saiba que os grânulos de pigmento contribuir para esta mudança de cor, a sua composição permanece desconhecido. Descreve-se um processo para isolar e purificar chromatophore pigmentos que podem ser adaptados para futuros estudos de composição.

O isolamento de grânulos de pigmento envolve a extração de várias etapas, homogeneização, e processo de purificação. ^3,12 chromatophore tecido contendo é colhido através de extirpação cuidado do cefalópode. Um processo de digestão e homogeneização é então utilizado para dissociar o tecido circundante e separar as células chromatophore. Os grânulos nanoestruturados são, em seguida, isolado e purificado a partir das chromatophores restantes usando sonicação e centrifugação repetida. Após purificação, os pigmentos são extraídos a partir dos grânulos em um processo que é uma adaptação da extracção de cor visível de asas de borboleta usando soluções de metanol ácidas. Microscopia de electrões ^{13 de} varredura (SEM) e espectrofotometria são usados para confirmar que os pigmentos chromatophore são extraídas com sucesso usando Este processo.

Este método descreve o isolamento de grânulos chromatophore que é usado para explorar as contribuições para C molecularesoloration em cefalópodes. ¹² extrações de moléculas pequenas de animais inteiros muitas vezes pode ser um processo longo e tedioso. O objetivo aqui é informar futuros pesquisadores de um protocolo eficaz e fácil para a aquisição de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em cefalópodes.

Protocolo

estudos com animais invertebrados aqui realizados não são regulamentados nos Estados Unidos; Por conseguinte, o Comité Cuidado e Uso Institucional animal não tem autoridade para revisão de tais protocolos. Em vez de estes não estão sob a jurisdição da regulação nos Estados Unidos, os autores declaram que estes estudos foram realizados com esforço sincero para o uso ético, cuidado e tratamento destes animais, o número de indivíduos foi minimizado e estes esforços são consistentes com a Declaração de Basileia e do Conselho Internacional para a Ciência animal Laboratory (ICLAS) diretrizes de ética.

1. Doryteuthis pealeii (pealeii D.) Dissection

1. Compra lulas decapitado D. pealeii do Departamento de Recursos Marinhos no Laboratório de Biologia Marinha de Woods Hole, MA ou de qualquer mercado de peixe fresco. Não utilizar amostras que foram filetes ou previamente alteradas, a fim de aplicar este procedimento. Especificamente, a cromacamada tophore deve ainda estar intacto na amostra.
   1. Se os animais não são utilizados imediatamente, armazená-las a -20 ° C até à sua utilização. Para descongelar os espécimes, colocá-los em água a temperatura ambiente por 1 hora antes da dissecção.
2. Usando aço inoxidável retas tesouras de dissecação de ponta fina, cortados ao longo do lado posterior do animal. Comece na base do manto ventral, e termina na região fin.
3. Remover todos os órgãos internos (estômago, de emalhar, glândula de tinta, órgãos reprodutores, coração sistêmica e coração braquial), levantando-los com dissecando uma pinça e cortar seu tecido conjuntivo usando tesouras de dissecação. Descarte órgãos em um saco de amostra.
4. Use dissecando T-pinos para fixar o manto (lado fin-se) em um padrão 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan dissecção de alumínio contendo uma almofada dissecção flexível. Mergulhe o tecido em 250 ml de água do mar que foi filtrada através de um sistema de filtração em vácuo de poliestireno descartáveiscontendo 0,2 uM tamanhos de poro.
5. Remova cuidadosamente a camada de pele epidérmico (cor opaca) com uma pinça de dissecação, mantendo a camada de pele chromatophore contendo intacta. Uma vez que a camada epidérmica é removido, descartá-lo num saco de amostra.
6. Dissecar pequenas seções (1 cm x 1 cm) da camada chromatophore com uma pinça e tesouras de dissecação. Recolher amostras de 1,5 ml em tubos de micro-centrifugação (preencher uma metade de cada tubo vazio com o tecido dissecado).
7. Adicionar 500 uL de água do mar filtrada para o tecido contendo tubos. As amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C.

2. Isolando chromatophore Pigment Granulados

1. digestão do tecido
   1. Preparação da papaína / colagenase
      1. Pesar 30 mg de colagenase e 5 mg de papaína usando um "x 4" baixo teor de azoto 4 pesar papel. Transferi-los em um 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno com tampa de rosca.
      2. Medir 10 ml de deionizágua ed usando uma pipeta graduada. Adicionar directamente ao frasco contendo papaína / colagenase. Vortex na configuração mais alta até que a solução é clara.
   2. Remoção de tecido extracelular
      1. Centrifuga-se o tecido recolhido a partir do passo chromatophore 1,7 durante 5 min a 14.000 x g. Descartar a camada superior da água do mar em um balde de resíduos de plástico.
      2. Adicionar 500 ul da solução de papaína / colagenase ao tecido usando uma P1000 de volume variável único canal micropipeta. Vortex cada amostra por 1-2 min na potência máxima.
      3. Sonicar as amostras durante 5 minutos a uma frequência de 40 kHz para dissociar as células a partir do tecido circundante.
      4. Centrifugar durante 5 min a 14.000 x g. Descartar o sobrenadante em um balde de resíduos de plástico.
      5. Centrifuga-se o tecido recolhido chromatophore durante 5 min a 14.000 x g. Descartar a camada superior da água do mar em um balde de resíduos de plástico. Repita mais uma vez.
      6. remover manualmente qualquer sec tecido grande restantesções que não digerem neste processo com uma pinça antes de prosseguir para o passo seguinte.
2. Isolando o pigmento Granulados
   1. Preparação de tampão de homogeneização
      1. Pesar 2,38 g de (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de cloreto de magnésio (10 mM), 0,856 g de potássio-aspartato (50 mM), e 0,015 g de ditiotreitol (1 mM). Transferir para um recipiente de poliestireno de 150 ml com uma tampa de rosca. Adicionar um mini-inibidor de protease tablet comercial.
      2. Medir 100 mL de água desionizada usando um cilindro graduado. Adicionar directamente ao recipiente que contém os sais de homogeneização. Vortex até a solução ficar clara.
   2. Homogeneização dos grânulos de pigmento
      1. Centrifugar cada amostra a partir do passo 2.1 a 14000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante em um balde de resíduos de plástico. Essa amostra deve ser vazio de tecido extracelular.
      2. Adicionar 500 &# 181; l de tampão de homogeneização e a cada tubo de vórtice durante 1-2 min cada para misturar bem as amostras. Sonicate as amostras para 30 min (~ 40 kHz) e seguir com 5 min de centrifugação a 14.000 x g.
      3. Descartar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico, e repetir a etapa anterior de 2-3 vezes para assegurar a digestão completa do sáculo e chromatophore proteína amarras. O restante da solução deve conter um sobrenadante de cor amarela clara e um pelete de cor vermelha contendo os grânulos de pigmento isolado.

3. Pigment Extração

1. Preparação de metanol ácido (HCl-MeOH)
   1. Adicionar cuidadosamente 25 mL de concentrado (36,5-38% (w / w)) de ácido clorídrico (HCl) a 5 ml de metanol (MeOH). Guardar a solução HCl-MeOH num frasco de amostra de vidro com tampa de rosca. Agite cuidadosamente para misturar uniformemente a solução.
      NOTA: O mais ácida à solução, a mais pigmento será extraído durante o fiextração de primeira.
2. Extracção de Pigmento
   1. Centrifugar a suspensão de pigmento de grânulos (a partir de 2.2.2) durante 5 min a 14000 xg e desprezar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico.
   2. Adicionar 500 ul da solução de HCl-MeOH e agitar com vortex para cada amostra de ~ 3-4 min. Sonicar as amostras durante 10 min (~ 40 kHz), depois centrifugar durante 5 min a 14.000 x g.
   3. Usando uma pipeta, recolher o sobrenadante num frasco com tampa de vidro de 1 dram. O sobrenadante deve ser vermelho escuro na cor.
   4. Repita o 3.2.2 etapa de extração até que este é extraído (~ 4-5 lavagens).
      NOTA: Cada extracção irá produzir ~ 1,5 mL de pigmento. O sedimento incolor remanescente é extraída os grânulos de pigmento. NOTA: Ambos os grânulos incolores e pigmentos extraídos podem ser armazenados em água a 4 ° C até uso posterior.

4. Caracterização ao longo Processo de Extracção

1. digitalização Electron Microscopia
   1. Imagem dos grânulos (que não reagiram a partir do passo 2.2.1 e 3.2.3 do passo extraiu-pigmento) usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para verificar a pureza do processo de extração.
   2. Para preparar as amostras de grânulos para imagiologia, primeiro de centrifugação tanto grânulos que não reagiram e de pigmento extraído grânulos durante 5 min a 14.000 xg, e desprezar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico. Re-suspender estes em 1 ml de etanol, e depósito de 2-3 gotas da suspensão de grânulos Onto topos de alumínio SEM utilizando uma pipeta de transferência.
   3. Depois de se secar as amostras durante a noite, revestir com revestimento de ouro-platina durante 3 min para obter um revestimento de 15 nm.
   4. Imagem usando um MEV com um emissor de Schottky e um detector de electrões secundário. Use uma tensão feixe de 5-7 kV e uma distância de trabalho entre 8 e 9 mm para a imagem destes materiais.
2. Usando espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-VIS)
   1. Monitorar o pro absorçãoarquivos para todas as 3 condições (grânulos que não reagiu a partir 2.2.2, pigmento extraído do 3.2.3, e pigmento extraído grânulos de 3.2.4) usando um espectrofotômetro de feixe duplo 200-800 nm.
   2. Recolha uma medição em branco utilizando água desionizada numa cuvete de 1 mL para os grânulos que não reagiram e os grânulos de pigmento extraído. Recolha espectros de absorção UV-Vis para ambas as amostras.
   3. Recolha uma medição em branco utilizando a solução de metanol ácido numa cuvete de 1 ml para o pigmento extraído. Recolha espectro de absorção UV-Vis para a amostra.
   4. Determinar o comprimento de onda máximo de cada amostra por meio da identificação do comprimento de onda em que o pico de absorvância atinge a sua altura máxima relativa.

Resultados

Cromatóforos são dissecados a partir do D. pealeii manto dorsal (Figura 1A, 1B). Uma vez que são removidas, chromatophores são lisadas e purificada utilizando ciclos de centrifugação e lavagem para isolar os grânulos pigmentados (Figuras 2A, 2B). Soluções de metanol ácido (HCl-MeOH) são usadas para extrair o pigmento a partir dos grânulos (Figura 2C), obtendo-se um extracto de pigmen...

Discussão

Nós demonstramos um método para extrair pigmentos a partir de grânulos chromatophore lula. Alvejando especificamente os grânulos, o nosso objectivo é determinar seu papel na mediação coloração adaptativa. Este método difere relatórios anteriores concebidos para caracterizar pigmentos cefalópodes utilizando amostras de tecidos em massa ¹⁴ ou liofilizados pele ^15.

Embora este protocolo é eficaz na extração de pigmentos chromatophore, ela é limitada a peque...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant