Метод извлечения Пигменты из кальмаров<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Введение

Головоногие , такие как кальмары, каракатицы и осьминоги имеют возможность динамически изменять их внешний вид для маскировке и сигнализации. ^1-6 Эта возможность поддерживается частично за счет селективного расширения ареала пигментных органов , известных как хроматофоров. ^4,7-9 Хроматофоры являются мягкие приводы , которые содержат сеть наноструктурированных гранул пигмента заключены внутри cytoelastic саккулюса, которая закрепляется в радиальном направлении от мышечных волокон. ^1,3 Как они приводятся в действие, хроматофоры расширить на 500% площади поверхности , представленной распределяя гранулы по всему органу. ^{3,7 , 10,11} Когда это действие согласованные в течение ряда хроматофорами, общая окраска животного изменяется. Хотя известно, что гранулы пигмента способствуют этому изменению цвета, их состав остается неизвестным. Опишем процедуру для выделения и очистки хроматофора пигменты, которые могут быть адаптированы для будущих композиционными исследований.

Выделение гранул пигмента включает многоступенчатую экстракцию, гомогенизацию и процедуру очищения. ^3,12 хроматофора содержащий ткани собирают путем тщательного экстирпации из головоногих. Процесс переваривания и гомогенизация затем используется для диссоциировать окружающие ткани и отделяют хроматофора клетки. Наноструктурные гранулы затем выделяют и очищают из оставшихся хроматофорами повторными ультразвуковую обработку и центрифугирование. После очистки, пигменты извлекаются из гранул в процессе , который приспособлен от добычи видимого цвета с крыльями бабочки с использованием кислых растворов метанола. ¹³ с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) и спектрофотометрии используются для подтверждения того, что хроматофора пигменты успешно извлечены с помощью этот процесс.

Этот метод описывает выделение хроматофора гранул, который используется для изучения молекулярных вклад в Coloration в головоногих. ¹² Небольшие молекулы Выписки из всех животных часто может быть долгим и трудоемким процессом. Целью здесь является информирование будущих исследователей эффективного и легкому протокола для приобретения пигментов из наноструктурированных гранул в головоногих.

протокол

Исследования, проведенные на животных Беспозвоночные в настоящем документе, не регулируется в Соединенных Штатах; Поэтому по уходу и использованию животных комитет Institutional не имеет полномочий для рассмотрения таких протоколов. Вместо них, не подпадающих под юрисдикцию регулирования в Соединенных Штатах, авторы настоящим заявляю, что эти исследования были проведены с искренние усилия к этическому использованию, уходу и лечению этих животных, число людей, было сведено к минимуму, и эти усилия согласуются с положениями Базельской декларации и Международного совета по науке лабораторных животных (ICLAS) руководящих принципов этики.

1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Вскрытие

Покупка обезглавлены кальмар D. pealeii из Департамента морских ресурсов в Морской биологической лаборатории в Вудс - Хоул, штат Массачусетс или из любого свежего рыбного рынка. Не следует использовать образцы, которые были скругленные или ранее изменены, чтобы применить эту процедуру. В частности, цветностьtophore слой должен оставаться нетронутым на образце.
1. Если животные не используются сразу, хранить их при температуре -20 ° С до использования. Для размораживания образцов, поместите их в воде комнатной температуры в течение 1 ч перед вскрытием.
Использование нержавеющей стали прямые тонкой точкой рассечение ножницами, разрезать вдоль задней части животного. Начало у основания вентральной мантии, и заканчивается в области плавника.
Удалить все внутренние органы (желудок, жабры, чернила железы, половых органов, системные сердца, и плечевая сердца), поднимая их с рассекает щипцов и разъединяя их соединительной ткани с помощью рассечение ножницами. Откажитесь органы в образце мешок.
Используйте рассекает T-булавки, чтобы прикрепить мантию (плавник стороной вверх) в стандартном 11-1 / 2 "х 7-1 / 2" х 1-1 / 2 "алюминиевая рассечение ванночку, содержащую гибкую рассечение площадку. Погрузите ткань в 250 мл морской воды, которая была отфильтрована через систему вакуумной фильтрации одноразовые из полистироласодержащий размеры пор 0,2 мкм.
Осторожно снимите слой эпидермиса кожи (непрозрачный цвет) с рассекающих пинцетом, держа хроматофора содержащий слой кожи нетронутыми. После того, как эпидермальный слой удаляется, отбросить его в образце мешок.
Рассеките небольшие (1 см х 1 см) участки хроматофора слоя с пинцетом и рассечение ножницами. Сбор образцов в 1,5 мл микро-центрифужные пробирки (заполнить одну половину каждой пустой трубы с рассеченной ткани).
Добавьте 500 мкл отфильтрованной морской воды в ткани, содержащей трубки. Образцы могут храниться в течение ночи при температуре 4 ° С.

2. Разделительный хроматофора пигментные гранулы

Ткань Переваривание
1. Получение папаин / коллагеназы
  1. Взвешивают 30 мг коллагеназы и 5 мг папаин с использованием 4 "х 4" азот низкого вес бумаги. Передача их в полипропиленовую центрифужную пробирку емкостью 50 мл с завинчивающейся крышкой.
  2. Мера 10 мл deionizе изд воды с помощью градуированной пипетки. Добавить непосредственно в пробирку, содержащую папаин / коллагеназы. Vortex на максимальных настройках, пока раствор не станет прозрачным.
2. Удаление внеклеточного Ткань
  1. Центрифуга собранной хроматофора ткани от стадии 1.7 в течение 5 мин при 14000 х г. Выбросить верхний слой морской воды в ведро пластиковых отходов.
  2. Добавьте 500 мкл раствора папаина / коллагеназы на ткань с использованием P1000 переменного объема одноканальный микропипетки. Vortex каждый образец в течение 1-2 мин на максимальных настройках.
  3. Разрушать ультразвуком образцов в течение 5 мин при частоте 40 кГц, чтобы диссоциировать клетки от окружающей ткани.
  4. Центрифуга в течение 5 мин при 14000 х г. Удалите супернатант в ведро пластиковых отходов.
  5. Центрифуга собранной хроматофора ткани в течение 5 мин при 14000 х г. Выбросить верхний слой морской воды в ведро пластиковых отходов. Повторите еще раз.
  6. Вручную удалите оставшуюся большую тканевую секции, которые не переваривают в этом процессе с щипцами, прежде чем перейти к следующему шагу.
Выделяя пигментные гранулы
1. Подготовка буфера усреднении
  1. Взвешивают 2,38 г (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота) (HEPES, 100 мМ), 0,095 г хлорида магния (10 мМ), 0,856 г калия-аспартата (50 мМ), и 0,015 г дитиотреитола (1 мМ). Перенести в полистироловые контейнер емкостью 150 мл с завинчивающейся крышкой. Добавьте один ингибитор коммерческий мини-таблетка протеазы.
  2. Мера 100 мл деионизированной воды с помощью градуированного цилиндра. Добавить непосредственно в контейнер, содержащий соли гомогенизацией. Vortex до решения ясна.
2. Усреднение пигментные гранулы
  1. Центрифуга каждого образца, начиная с шага 2.1 при 14000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант в ведро пластиковых отходов. Этот образец должен быть лишенной внеклеточного ткани.
  2. Добавить 500 &# 181; л буфера для гомогенизации в каждую пробирку и вихря в течение 1-2 минут каждый, чтобы тщательно перемешать образцы. Разрушать ультразвуком образцов в течение 30 мин (~ 40 кГц), а затем с 5 мин центрифугирования при 14000 х г.
  3. Удалите супернатант в ведро пластиковых отходов, и повторите предыдущий шаг 2-3 раза, чтобы обеспечить полное переваривание в хроматофор саккулюс и белка фалов. Оставшийся раствор должен содержать светло-желтый супернатант и красного цвета осадок, содержащий отдельные гранулы пигмента.

3. Пигмент Extraction

Получение кислым метанолом (HCl-MeOH)
1. Осторожно добавьте 25 мкл концентрированной (36.5-38% (вес / вес)) хлористо-водородной кислоты (HCl) в 5 мл метанола (MeOH). Хранить раствор HCl-MeOH в стеклянном флаконе с завинчивающейся крышкой образца. Вихревой осторожно, чтобы равномерно перемешать раствор.
  Примечание: Чем более кислый раствор, тем больше пигмент будет извлекаться в течение фипервый экстракции.
Добыча Пигмент
1. Центрифуга суспензия пигмента гранул (от 2.2.2) в течение 5 мин при 14000 х г и отбросить супернатант в ведро пластиковых отходов.
2. Добавьте 500 мкл раствора HCl в MeOH и вихревые каждый образец на ~ 3-4 мин. Разрушать ультразвуком образцов в течение 10 мин (~ 40 кГц), а затем центрифугировать в течение 5 мин при 14000 х г.
3. С помощью пипетки передачи, сбора супернатанта в завинчивающейся крышкой стеклянную пробирку 1 драмовом. Супернатант должен быть темно-красного цвета.
4. Повторите стадию экстракции 3.2.2 до тех пор, не далее цвет не извлекается (~ 4-5 промывок).
  Примечание: Каждая экстракция даст ~ 1,5 мл пигмента. Оставшийся осадок бесцветный пигмент, извлеченный гранулы. Примечание: бесцветные гранулы и экстрагированные пигменты могут храниться в воде при температуре 4 ° С до дальнейшего использования.

4. Характеристика на протяжении процесса экстракции

Сканирование Эльectron Микроскопия
1. Изображение гранулы (не вступившие в реакцию со стадии 2.2.1 и пигмент-извлеченного из стадии 3.2.3) с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), чтобы проверить чистоту процесса экстракции.
2. Для подготовки образцов гранула для обработки изображений, первый центрифуге обоих непрореагировавших гранул и пигментных извлеченный гранул в течение 5 мин при 14000 х г, и отбросить супернатант в ведро пластиковых отходов. Повторное приостановить их в 1 мл этанола, и хранилищами 2-3 капли суспензии гранул на алюминиевую SEM пней с использованием передачи пипетки.
3. После сушки образцов в течение ночи, разбрызгивание пальто с золотым покрытием из платины в течение 3 мин, чтобы достигнуть 15-нм покрытие.
4. Изображение с помощью сканирующего электронного микроскопа с Шоттки излучатель и детектор вторичных электронов. Используйте напряжение пучка 5-7 кВ и рабочее расстояние между 8 и 9 мм до изображения этих материалов.
Видимой области ультрафиолетового (UV-VIS) спектрофотометрических измерений
1. Контроль за абсорбцию профайлы для всех 3-х условий (непрореагировавший гранула из 2.2.2, экстрагируют пигмент из 3.2.3, и пигмент экстрагируют гранулы из 3.2.4) с использованием двойной спектрофотометр пучка от 200-800 нм.
2. Сбор пустой измерение с помощью деионизованной воды в 1 мл кювету для непрореагировавших гранул и пигментных извлеченный гранул. Собирают спектры поглощения UV-VIS для обоих образцов.
3. Сбор пустой измерение с помощью кислотного раствора метанола в 1 мл кювету для извлеченного пигмента. Собирают UV-VIS спектр поглощения для образца.
4. Определить максимальную длину волны каждого образца путем определения длины волны, при которой оптическая плотность пик достигает максимального значения относительной высоты.

Результаты

Хроматофоры отсекают от D. pealeii спинные мантии (рис 1А, 1В). После того, как они будут удалены, хроматофоры лизируют и очищают с помощью центрифугирования и циклов стирки , чтобы выделить из пигментные гранулы (Фигуры 2А, 2В). Кислотн...

Обсуждение

Мы продемонстрировали метод извлечения пигментов из кальмаров хроматофора гранул. Конкретное ориентации гранул, наша цель состоит в том, чтобы определить их роль в опосредовании адаптивную окраску. Этот метод отличается от предыдущих отчетов , предназначенных для характеристики гол?...

Раскрытие информации

We have nothing to disclose.

Благодарности

The authors gratefully acknowledge the use of facilities at the University of New Hampshire including the University Instrumentation Center. This work was supported by the University of New Hampshire, Department of Chemistry.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant