قياس النتريت والنترات، الأيضية في اكسيد النيتريك المسار، في المواد البيولوجية باستخدام أسلوب التوهج

Summary

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Abstract

أكسيد النيتريك (NO) هي واحدة من الجزيئات منظم الرئيسية في التوازن الأوعية الدموية وكذلك الناقلات العصبية. يتأكسد أنتجت إنزيمي NO إلى النتريت والنترات من التفاعل مع مختلف البروتينات أوكسي الهيم وغيرها من مسارات تزال غير معروفة. عملية عكسية، انه تم اكتشاف الحد من النتريت والنترات إلى NO في الثدييات في العقد الماضي، وتحظى باهتمام واحدة من المسارات الممكنة إما منع أو تخفيف مجموعة كاملة من القلب والأوعية الدموية، التمثيل الغذائي واضطرابات العضلات التي يعتقد أن تترافق مع انخفاض مستويات NO. ولذلك فمن المهم لتقدير كمية NO وعناصره في أماكن الجسم المختلفة - الدم وسوائل الجسم والأنسجة المختلفة. الدم، نظرا لسهولة الوصول إليها سهلا، غير مقصورة يفضل استخدامها لتقدير NO الأيض. نظرا لعمر البطارية القصير (أجزاء قليلة من الثانية)، وانخفاض تركيز الفرعية nanomolar، قياسات مباشرة وموثوقة من الدم NO <em> في الجسم الحي الحالية صعوبات تقنية كبيرة. ومن ثم، يقدر لا توفر عادة على أساس كمية من منتجاتها الأكسدة، والنتريت والنترات. دائما قياس هذه الأيض بشكل منفصل. هناك عدة طرق راسخة لتحديد تركيزها في السوائل والأنسجة البيولوجية. هنا نقدم بروتوكول لطريقة التوهج (CL)، استنادا إلى الكشف spectrophotometrical من NO بعد نتريت أو نترات الحد من ثلاثي يوديد أو الفاناديوم (III) حلول كلوريد، على التوالي. حساسية لالنتريت والنترات الكشف هو في نطاق منخفض nanomolar، الذي يحدد CL كأسلوب الأكثر حساسية المتاحة حاليا لتحديد التغيرات في NO المسارات الأيضية. نحن يشرح بالتفصيل كيفية تحضير عينات من السوائل والأنسجة البيولوجية من أجل الحفاظ على كميات الأصلية من النتريت والنترات موجودة في ذلك الوقت من جمع وكيفية تحديد كميات كل منها في العينات. القيود المفروضة على تقنية CL هي أيضا إكسبlained.

Introduction

النتريت، وإلى أقل تمديد نترات، ومستويات في الدم تعكس الحالة العامة للجسم NO الأيض. تركيزات النيتريت في الدم ومعظم الأعضاء والأنسجة ليست سوى في nanomolar ارتفاع أو انخفاض مجموعة مكرومولي، نترات موجودا عادة بكميات أعلى من ذلك بكثير - في نطاق مكرومولي. التغيرات في مستويات نتريت نتيجة لتطور المرض أو التغيرات في العادات الغذائية هي صغيرة جدا، ويمكن قياسها فقط باستخدام طريقة حساسة جدا. بسبب مختلف جدا مستوياتهم وعمليات الأيض المختلفة، تقرير منفصل من مستويات النتريت والنترات أمر ضروري. ما يسمى ب "أكاسيد _{النيتروجين} تقرير" حيث يتم قياس النتريت والنترات معا له قيمة ضئيلة جدا.

وقد وضعت عدة طرق لقياس النتريت في مختلف العينات البيولوجية - الأكثر شيوعا هي أقدم واحد، استنادا إلى رد فعل Griess التي تم وصفها في الأصل في عام 1879. وحتى مع modificatio الحديثم، والحد حساسية لالنتريت يمكن بلوغه من خلال طريقة Griess "في مجموعة مكرومولي منخفضة. التوهج (CL)، جنبا إلى جنب مع ثلاثي يوديد الحد من الحل، ويعتبر في الوقت الراهن الأسلوب الأكثر حساسية، مما يسمح الكمي في نطاق nanomolar انخفاض تركيزات النتريت ^1-8،10،11. نفس الأسلوب CL، جنبا إلى جنب مع الفاناديوم (الثالث) كلوريد الحد من الحل، ويمكن استخدامها لقياس حساسة من النترات، مع الدقة في نطاق nanomolar ^9.

CL يكشف NO الغاز الحر. لذلك، والنتريت والنترات وR-nitrosothiols (R-SNO)، R-nitrosoamines (R-NNO)، أو مركبات معدنية-NO (في وقت لاحق في مخطوطة النحو المشار إليه "R- (X) الذي تكن له")، لا بد من تحويلها إلى تحرير NO الغاز من أجل تحديد قيمها الأصلية عن طريق CL. وحققت التحويل إلى NO تستخدم عدة حلول الحد مختلفة، اعتمادا على طبيعة NO الأيض. بعد التحويل، يتم إزالة الحرة NO الغاز من وعاء التفاعل من قبل الناقل للغاز (و، N2 أو هارون) في دائرة رد الفعل من CL محلل حيث يتم الجمع بين الأوزون (O ₃₎ مع NO لتشكيل ثاني أكسيد النيتروجين (NO ₂₎ في حالته تفعيلها. مع العودة الى ارض الدولة، NO ₂ * تنبعث في منطقة الأشعة تحت الحمراء، والكشف عن الفوتون المنبعث من مضخم (PMT) صك CL. شدة الضوء المنبعث يتناسب طرديا مع تركيز NO في دائرة رد الفعل، والذي يسمح حساب تركيز الأنواع الأصلية باستخدام منحنيات المعايرة المناسبة.

في بروتوكول لدينا، ونحن الحالي أول تقرير يستند CL من النتريت والنترات في إعدادات السريرية الأكثر استخداما - في الدم والبلازما، وبعد ذلك نناقش كيفية تحديد هذه الأيونات في عينات الأنسجة. نفسر أيضا بالتفصيل كيفية الحفاظ على تركيز النتريت الفسيولوجية الأصلي في بيئات النتريت رد الفعل، مثل الدم والمقصورات لها والبلازما وخلايا الدم الحمراء.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات بما في ذلك استخدام الحيوانات لاستخدامها من قبل NIDDK رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام والحصول على الدم البشري من المعاهد الوطنية للصحة بنوك الدم من المتبرعين الأصحاء.

التحضير 1. عينة

1. إعداد النتريت الحفاظ الحل
   1. تحضير محلول يحتوي على 890 ملي فيري سيانيد البوتاسيوم (K ₃ الحديد (CN) ₆₎ و 118 ملي NEM (N-ethylmaleimide) في الماء المقطر. حل جيد حتى يتبين الأصفر مع عدم وجود بلورات الحالية. إضافة NP-40 (الأوكتيل phenoxylpolyethoxylethanol) في 1: 9 نسبة (ت / ت، NP-40 / الحل). المزيج بلطف لتجنب رغوة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة اسبوع تقريبا).
2. جمع وإعداد عينات الدم
   1. جمع الدم باستخدام ما لا يقل عن إبرة 20 G لتجنب انحلال الدم مع الهيبارين لمنع تجلط الدم (5 U / مل). بالنسبة للعينة دم كاملة، خلط الدم مع النتريت المحافظة عليها حل فورا في نسبة 4: 1 (ت/ ت حل / الدم).
   2. البلازما وخلايا الدم الحمراء العينات، الطرد المركزي الدم التي تم جمعها لمدة 5 دقائق في 4000 x ج في 4 درجات مئوية لفصل خلايا الدم الحمراء (RBC) والبلازما. اتخاذ طاف (البلازما) ومزجها مع النتريت المحافظة عليها حل كما هو موضح أعلاه لتحديد مستويات النتريت في البلازما.
   3. إزالة بعناية المتبقية البلازما ومعطف الشهباء من العينة وماصة RBC عينة من الجزء السفلي من أنبوب لتجنب التلوث من أنواع أخرى من خلايا الدم باستخدام ماصة قطع، وتحويلها إلى أنبوب يحتوي على النتريت الحل الحفاظ في نفس نسبة النحو الوارد أعلاه.
   4. خلط كل عينة (البلازما وكريات الدم الحمراء) مع الميثانول الباردة بنسبة 1: 1 أو 1: 2 (ت / ت عينة / الميثانول) وأجهزة الطرد المركزي لهم في 13000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لترسيب البروتينات. اتخاذ طاف واستخدامها لقياس النتريت أو تجميد عينات استعداد، إذا لزم الأمر، على الثلج الجاف ومخزن في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: النطرون ريا بسرعةسنت مع الأوكسي هيموغلوبين (oxyHb) في الدم تشكيل نترات. منذ oxyHb الحاضر دائما في فائض كبير على النتريت، وهذا التفاعل يؤدي إلى إبادة كاملة تقريبا من النتريت الدم الأصلي مع الإطار الزمني ~ 10 دقيقة. من أجل الحفاظ على معظم الذاتية النتريت الدم، يضاف حل الحفاظ على النتريت إلى عينات دم كامل على الفور بعد سحب الدم. فإن الحل ليز بسرعة خلايا الدم الحمراء وأكسدة oxyHb إلى ميتهيموغلوبين (metHb)، شكل غير نشط من الهيموغلوبين التي لا تتفاعل كيميائيا مع النتريت.
3. إعداد عينات من أنواع أخرى من السوائل في الجسم
   1. بعد جمع العينات في وعاء مناسب، وتخلط جيدا مع النتريت الحفاظ على الحل، deproteinate وقياس فورا أو تجميد وتخزين في -80 درجة مئوية.
4. جمع وإعداد عينات الأنسجة
   1. جمع الأنسجة من الحيوانات مع perfused heparinized محلول ملحي (10 U HEPAرين / مل). المكوس حوالي 1 غرام من الأنسجة المطلوبة والتجانس إما باستخدام الخالط اليدوي أو الخالط الآلي.
   2. إضافة كمية معروفة من النتريت الحفاظ الحل حسب الحاجة لتحقيق جناسة على نحو سلس.
   3. مرة واحدة الأنسجة المتجانس، تترسب البروتينات باستخدام الميثانول الباردة (1: 1 أو 1: 2 نسبة ت / ت عينة / الميثانول) كما هو موضح أعلاه، عينات ثم الطرد المركزي في 13000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   4. جمع مستويات النتريت طاف والتدبير. إذا لزم الأمر، وتجميد عينات في أي مرحلة من مراحل الإعداد على الثلج الجاف ومخزن في -80 درجة مئوية.

2. إعداد الحد حلول

1. ثلاثي يوديد (ط ₃₎ الحد من حل لالنتريت وتقرير ^1،3،4 R- (X) الذي تكن له الأنواع
   1. يعد حل 301 ملم KI جنبا إلى جنب مع 138 ملي I ₂ حل في الماء. خلط مع حمض الخليك الجليدية في 2: 7 نسبة (ت / ت حل / حمض) على محرك مغناطيسي ل~ 30 دقيقة حتى كلتذوب البلورات. إبقاء ويفضل أن يكون في زجاجة داكنة، كما يوديد غير الحساسة للضوء، واستخدام خلال أسبوع واحد من الإعداد.
      ملاحظة: هذا الحل تقليل النيتريت إلى NO وانها ستفرج أيضا لا من R-SNO، R-NNO والحديد-NO المجموعات الوظيفية (R- (X) الذي تكن له)، ولكن لن تتأثر نترات. إشارة من المجموعات الوظيفية المذكورة أعلاه على أساس لا يمكن فصلها عن إشارة النتريت الحقيقية عن طريق العلاج من نصف العينة مع سلفانيلاميد المحمض (ع) وتقارن تعامل AS-وإشارة غير المعالجة. يشكل AS لا رجعة فيه الديازونيوم الموجبة مع النتريت ولا يمكن تخفيض هذا المجمع التي كتبها I ₃ الحل. لAS العلاج، وإعداد 290 ملي حل لسلفانيلاميد في 1 M حمض الهيدروكلوريك وإضافته إلى قسامة العينة في نسبة 1: 9 (ت / ت AS / العينة). قياس إشارة CL في أجزاء المعاملة AS وغير المعالجة من العينة. حساب إشارة النتريت الحقيقية كما بفارق المعاملة AS وغير المعالجة جزء من العينة. النتريت يمكن أن تقاس أيضا باستخدام أحمق انتقائيةطقوس الحد من حل الاسكوربيك / خليط حامض الخليك كما هو موضح في الجزء 2.2. ومع ذلك، نظرا لكمية عادة ما تكون صغيرة من R- (X) الذي تكن له الأنواع الموجودة، والقياسات باستخدام عينات AS-غير المعالجة، في معظم الحالات تقريب جيد جدا من إجمالي محتوى النتريت.
2. حمض الأسكوربيك / حامض الخليك (4A) حل لتقرير انتقائية من النتريت ²
   1. إعداد 500 ملي حامض الاسكوربيك في الماء. مزيج هذا الحل مع حمض الخليك الجليدي في نسبة 1: 7 (ت / ت، حمض الأسكوربيك / حامض الخليك) لإعداد خليط التفاعل.
      ملاحظة: هذا الحل هو محدد لالنتريت، لن تطلق سراح NO من أي R- (X) الذي تكن له الأنواع أو نترات. ومع ذلك، فإن حل الاسكوربيك وحمض الخليك يجب الطازجة قبل كل يوم القياسات، وحمض الاسكوربيك يتأكسد بسهولة في الحل.
      الانتهاء من إجراء تخفيض النتريت يعتمد على تركيز حامض الاسكوربيك. ويوصى لا يقل عن 50 ملم حمض الأسكوربيك لص الكاملالاستنباط من النتريت البلازما. ومع ذلك، فمن المستحسن لإجراء بعض التجارب الرائدة مع تركيزات مختلفة من حمض الاسكوربيك والمعايير النتريت في نطاق تركيز النتريت المتوقع قبل لقياسات العينة النهائية. نضع في اعتبارنا أن حمض الاسكوربيك يستنزف طفيفا خلال القياسات، وينصح التغييرات المتكررة حتى من خليط التفاعل في دائرة رد الفعل الزجاج.
3. الفاناديوم (الثالث) كلوريد حل الحد لتحديد نترات ⁹
   1. إعداد 51 ملي حل VCL ₃ في 1 M حمض الهيدروكلوريك. حل تصفية من خلال تصفية 200 ميكرون وتخزينها في زجاجة داكنة، واستخدام في غضون أسبوعين.
      ملاحظة: هذا الحل تقلل النترات والنتريت وجميع R- (X) الذي تكن له الأنواع، لذلك إذا كمية معتبرة من النتريت أو غيرها R- (X) الذي تكن له الأنواع موجودة جنبا إلى جنب مع نترات، ومحتوى النترات النهائية يجب أن تكون محسوبة بالفرق بين الإشارات CL التي تم الحصول عليها مع VCL ₃ و أنا₃ الحد من الحلول.

3. التوهج (CL) إعداد محلل والمقاييس

1. حل قياسي
   1. إعداد 1 ميكرومتر حل نتريت الصوديوم (نانو _2). نفس الحل يمكن استخدامها لالنتريت والنترات القرارات.
2. باستخدام NO محلل
   ملاحظة: حاليا هناك نوعان المتاحة تجاريا NO تحليل حساسة بما فيه الكفاية لأغراض الأبحاث البيولوجية - سيفرز نوا وEcophysics CLD 88Y. كلاهما يعمل على نفس المبدأ. والفرق الرئيسي هو أن CLD 88Y يستخدم الأوكسجين من هواء الغرفة لجعل طبقة الأوزون (O _3)، في حين يتطلب نوا دبابة الأكسجين الخارجي لهذا الغرض. يصف الإجراء أدناه مجموعة تصل لسيفرز نوا.
   1. إعداد الصك
      1. أداء مجموعة أولية تتكون من NO محلل وفقا لتوصيات الشركة المصنعةكما نشاهد في الشكل 1.
      2. فتح O ₂ خزان متصلا الصك. اختيار "التحليل" و "الدخول" من القائمة الرئيسية على اللوحة الأمامية. على الشاشة التالية اختر "ابدأ"، ثم اضغط على "دخول". ربط فخ الحمضية (التي تحتوي على 1 م هيدروكسيد الصوديوم) في الصك كما رأينا في الشكل 1.
      3. انتظر حتى يبرد مضخم إلى درجة حرارة أقل من -12 درجة مئوية، ويتم اخلاء دائرة رد الفعل إلى 6 عربة. يستغرق حوالي 30 دقيقة للوصول إلى خط الأساس مستو ثابت. خط الأساس يحتاج إلى استقرار داخل 1-2 بالسيارات، والقيمة الاسمية أقل أهمية من استقرارها.
         ملاحظة: إذا تم قياس النترات، بدوره على حمام مياه التبريد (وضعت في 4 درجات مئوية، والتي تخدم الفخ الذي وقع البارد لأبخرة الحامض والماء) وحمام تسخين المياه (دائرة رد الفعل الرئيسي، 95 درجة مئوية). معدل الحد من نترات إلى NO في VCL ₃ الحل تعتمد على درجة الحرارة، وأنها بطيئة جدا في تيمبي الغرفةrature، هناك حاجة إلى زيادة كبيرة جدا من درجة الحرارة إلى مراقبة رد فعل.
      4. فتح خزان ووتوصيل دائرة رد الفعل الزجاج إلى اعتراض حمض كما نشاهد في الشكل 1. ملء دائرة رد الفعل مع حل الحد المناسب، والحد من السطح إلى الحد الأدنى وربط دائرة رد الفعل إلى فخ الحمضية. عن طريق التجربة والخطأ، وضبط معدل السطح ولتتناسب مع معدل شفط أداة (عادة ~ 200 مل / دقيقة لنوا الغربال مماثل ل).
      5. تشغيل الكمبيوتر السيطرة على الصك وبدء برنامج السائل أساس ابفيف. لتشغيل الاتصالات بين الصك واقتناء البرمجيات، اضغط على "دخول" عندما تكون في "قائمة البيانات" حتى يقرأ الشاشة "الناتج تمكين"، ثم اضغط على "واضحة" للعودة إلى الشاشة البيانات.
      6. الانتظار للحصول على أثر الأساس مستقر على الشاشة والبدء في ضخ العينات والمعايير النتريت إلى الحد من الحل من خلال الحاجز. ننتظر دائما للوصول إلى الخلف أساسية مستقرةإيه الذروة. وهذا يمكن أن يستغرق ما يصل الى 2 دقيقة. البرنامج السائل لديه خيار "علامة" أوقات الحقن والحواشي وحقن، وسوف تصدر هذه التعليقات في ملف منفصل (filename.info) باعتباره مكملا مفيدا لملف البيانات (filename.data).
      7. مرة واحدة يتم قياس العينات والمعايير، واختيار "وقف" خيار في قائمة البرامج السائلة - وهذا سوف كتابة البيانات من ملف مؤقت في ملف دائم المعروف باسم "filename.data". والضغط على خيار "إجهاض" إنهاء قياس دون كتابة البيانات التي حصل عليها في ملف دائم.
      8. لإنهاء التجربة، افصل الجهاز من وعاء التفاعل عن طريق إيقاف محبس على رأس عاء التفاعل وقطع الأنابيب بين فخ الحمضي وعاء التفاعل (انظر الشكل 1). الآن وقف نوا محلل - الصحافة "واضحة"، انتقل إلى "تحليل"، وضع الجهاز على "الاستعداد" والاستعداد "تأكيد". إذا ما استخدمت بشكل منتظم، وأداة يمكن أن تترك في وضع الاستعداد لعدة أسابيع. إيقاف إمدادات الأوكسجين. ثم مسح حل الحد من دائرة رد الفعل، قطع وإغلاق ودبابات من وعاء التفاعل والزجاج، والانتهاء من تنظيف عاء التفاعل.
   2. المعايير وحقن عينة
      1. ضخ 50 ميكرولتر من 1 ميكرومتر حل النتريت إلى خليط التفاعل باستخدام حقنة هاميلتون غسلها جيدا. انتظر على الأقل 1 - 2 دقيقة بين الحقن لتحقيق فصل جيد من القمم. تكرار الحقن من 50 ميكرولتر للحصول على التكرارات إلى كل نقطة بيانات. يغسل المحاقن مع الماء منزوع الأيونات بعد كل حقنة.
      2. للحصول على مجموعة كاملة من البيانات لمنحنى قياسي، تواصل مع الحقن مكررة من 100، 150 ميكرولتر (قد تكون هناك حاجة إلى 200 ميكرولتر إضافية إذا كان من المتوقع على تركيزات عالية من النتريت أو النترات) من 1 ميكرومتر حل النتريت. في كل حالة، ورعاية الانتظار حتى تنخفض إشارة إلى خط الأساس ومن ثم الحصول على 1-2 ميلن من خط الأساس لتحقيق فصل جيد من القمم.
         ويمكن قياس معايير النطرون في أي وقت خلال التجارب: مذكرة. ومع ذلك، فمن الأفضل للحصول على منحنى قياسي قبل قياس البيانات، كما أنه يخدم كآلية للرقابة من وظائف الجهاز.
         عندما يتم جمع البيانات، وكمية من عينة حقن ينبغي أن يؤدي إلى القمم وضوحا أيضا. ومع ذلك فإنه ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن مضخم خطي فقط يصل إلى ~ 800 فولت، لذلك لا شيء من ذروة ينبغي أن يكون أعلى من ~ 700 فولت. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق تقليل من كمية حقن عينة أو تمييع العينة مع الماء منزوع الأيونات. وينبغي قياس كل نقطة على الأقل في مكررة.

النتائج

ويبين الشكل 2 نتائج ممثل جمعها من المعايير وخمس عينات مختلفة. كما هو مبين في هذا الرقم، ويزيد من مضخم التيار الكهربائي مباشرة بعد حقن النتريت تحتوي على حل (معايير أو عينات) إلى الحد من حل (يشار إلى حقن مرات من قبل السهام الحمراء تحت منحنى) وال?...

Discussion

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

aliquots من كل الحلول (بما في ذلك الماء) المستخدمة في إعداد، وتمييع أو علاج عينات الأصلي يجب أن تحفظ ودققت لاحتمال النتريت أو (في كثير من الأحيان) تلوث نترات. وجدنا أن معظم التلوث يأتي من الماء والكثير من الم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics