Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu'ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Özet

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Özet

Nitrik oksit (NO) damar homeostazının ve aynı zamanda bir nörotransmiter ana düzenleyici moleküllerin biridir. Enzimatik olarak üretilen NO çeşitli oksi-heme proteinleri ve diğer hala iyi bilinmemektedir yollar ile etkileşimleri tarafından nitrit ve nitrat içine oksitlenir. Ters işlem, NO içine nitrit ve nitrat indirgeme son on yılda memelilerde keşfedildi ve o önlemek veya düşünülen kardiyovasküler, metabolik ve kas hastalıklarının bir dizi kolaylaştırmak için ya olası yolların biri olarak dikkat kazanıyor NO azalan düzeyleri ile bağlantılı olabilir. kan, vücut sıvıları ve çeşitli dokularda - Farklı vücut bölümlerinde NO ve metabolitlerinin miktarını tahmin etmek önemlidir. Kan, nedeniyle kolay erişilebilirlik, NO metabolitlerinin tahmini için kullanılan tercih edilen bölme olduğunu. Nedeniyle kısa ömrü (birkaç milisaniye) ve düşük alt nanomolar konsantrasyonu NO kan direkt güvenilir ölçümler <em> in vivo mevcut büyük bir teknik zorluklar. Böylece YOK kullanılabilirlik genellikle oksidasyon ürünleri, nitrit ve nitrat miktarına dayalı tahmin edilmektedir. Bu iki metabolitler her zaman ayrı ayrı ölçülür. biyolojik sıvılar ve dokular konsantrasyonlarını belirlemek için çeşitli iyi bilinen yöntem bulunmaktadır. Burada, sırasıyla üç iyodür veya vanadyum (III) klorür çözeltileri, nitrit veya nitrat indirgeme sonrası NO spektrofotometrik tespit göre, kemilüminesans yöntemi (CL) için bir protokol mevcut. nitrit ve nitrat tespiti için duyarlılık YOK metabolik yollarda değişiklikleri belirlemek için şu anda mevcut en hassas yöntem olarak CL setleri düşük nanomolar aralığında yer almaktadır. Biz örneklerinde kendi miktarlarını belirlemek için toplanması ve nasıl sırasında nitrit ve nitrat mevcut orijinal miktarda korumak için biyolojik sıvılarda ve dokulardan örnekler nasıl hazırlanacağını ayrıntılı olarak açıklar. CL tekniğinin sınırlamalar da exp vardırLained.

Giriş

Nitrit ve daha az uzatmak nitrat, kandaki düzeyleri vücutta genel devlete YOK metabolizmasını yansıtmaktadır. mikromolar - nitrit kandaki konsantrasyonu ve en çok organ ve dokuların sadece yüksek nanomolar ya da düşük mikromolar, nitrat çok daha yüksek miktarlarda, genellikle mevcut bulunmaktadır. nedeniyle hastalığın ilerlemesi nitrit düzeylerindeki değişiklikler veya diyet alışkanlıklarındaki değişiklikler oldukça küçük ve sadece çok hassas bir yöntem kullanılarak ölçülebilir. Çünkü onların çok farklı düzeylerde ve farklı metabolik süreçlerin, nitrit ve nitrat düzeyleri ayrı belirlenmesi esastır. Nitrit ve nitrat birlikte ölçülen çok az değere sahip olan "NO _x belirlenmesi" olarak adlandırılan.

Çeşitli biyolojik numunelerde nitrit ölçülmesi için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir - En yaygın başlangıçta bile, modern modificatio ile 1879 yılında açıklanan olmuştu Griess reaksiyonu dayalı, eski bir varlıkNS, Griess 'yöntemiyle elde edilebilen nitrit duyarlılık sınırı düşük mikromolar arasındadır. Tri-iyodür çözeltisi azaltılması ile birlikte Kemilüminesans (CL), şu anda nitrit konsantrasyonlarının ^1-8,10,11 düşük nanomolar aralığında sayılmasına olanak tanıyan, en hassas yöntem olarak kabul edilir. Vanadyum (III) klorür çözeltisi azaltılması ile birlikte, aynı CL yöntem olup, nanomolar aralıkta ⁹ hassasiyetle, nitrat, hassas ölçümler için de kullanılabilir.

CL ücretsiz gaz NO algılar. Bu nedenle, nitrit, nitrat, R-nitrozo tiyol (R TARGET), R NİTROSOAMİNLERİN (R NNO), ya da metal-NO bileşikleri (daha sonra el yazması olarak anılacaktır "R- (X) = NO"), dönüştürülmelidir CL aracılığıyla kendi özgün miktarlarda ölçmek için NO gazı boşaltın. NO dönüşüm NO metabolitin doğasına bağlı olarak, çeşitli indirgeyici çözüm kullanılarak elde edilir. Dönüştürmeden sonra, kuru NO gazı bir taşıyıcı gaz (O, N, reaksiyon kabından temizlenir2 veya ozon (O _3), azot dioksit oluşturmak üzere NO ile birleştirilir CL analizörünün reaksiyon haznesine, Ar) (NO _2), aktive edilmiş bir halde. Zemin durumuna dönüşü ile, NO ₂ * kızılötesi bölgede yayar ve yayılan foton CL aracının photomultiplier (PMT) tarafından tespit edilir. yayılan ışığın yoğunluğu, uygun bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak, orijinal türlerin konsantrasyonunun hesaplanmasını sağlar tepkime haznesi NO konsantrasyonu ile doğrudan orantılıdır.

Protokolde, biz en çok kullanılan klinik ortamlarda nitrit ve nitrat ilk bugünkü CL-bazlı tayininin - kan ve plazmada, ve sonra biz doku örneklerinde bu iyonları nasıl belirleneceği tartışmak. Biz de böyle bir kan ve bölmeleri, plazma ve kırmızı kan hücreleri olarak nitrit-reaktif ortamlarda, orijinal fizyolojik nitrit konsantrasyonunu korumak için nasıl ayrıntılı olarak açıklar.

Protokol

Hayvanların kullanımını dahil olmak üzere tüm protokoller NIDDK Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kullanılmak üzere onaylanmış ve insan kan sağlıklı donörlerden NIH Kan bankasından elde edilmiştir.

1. Numune Hazırlama

1. Nitrit koruyucu çözeltisinin hazırlanması
   1. 890 mM potasyum ferrisiyanür ihtiva eden bir çözelti hazırlayın _(K3Fe (CN) ₆₎ ve damıtılmış su içinde 118 mM NEM (N-etilmaleimit). mevcut hiçbir kristalleri ile sarı netleşene kadar iyi çözülür. 9 oranı (h / h, NP-40 / çözelti) bir 1: NP-40 (oktil phenoxylpolyethoxylethanol) ekleyin. ) Yaklaşık bir hafta boyunca 4 ° C'de köpürme ve mağaza önlemek için yavaşça karıştırın.
2. Toplama ve kan örneklerinin hazırlanması
   1. pıhtılaşmayı (5 U / ml) önlemek için heparin ile hemoliz önlemek için en azından bir 20 G iğne kullanılarak kan toplayın. (4 oranında v: Tam kan örneği için, nitrit 1 hemen çözüm koruyarak ile kan mix/ Hac çözeltisi / kan).
   2. plazma ve kırmızı kan hücreleri numuneler için, santrifüj, 4 ° C'de 4000 x g'de 5 dakika boyunca alınan kan, kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ve plazma ayrılır. Süpernatant (plazma) almak ve plazma nitrit düzeylerinin belirlenmesi için, yukarıda tarif edildiği gibi nitrit çözeltisi korunması ile karıştırın.
   3. Dikkatli bir kesme pipet kullanarak kan hücrelerinin diğer türlerine göre kirlenmesini önlemek için borunun alt numune ve pipet eritrosit numunesinden plazmanın ve buffy coat kalan kaldırmak ve aynı nitrit koruyucu çözeltisi içeren bir tüp içine transfer yukarıdaki gibi oranı.
   4. 1 ya da 1: oranında 1 soğuk metanol ile her bir örnek (plazma ve RBC) karıştırın 2 (h / h örneği / metanol) ve proteinleri çökeltmek için 15 dakika boyunca 4 ° C'de 13,000 x g'de santrifüj. -80 ° C'de kuru buz ve mağaza, gerekirse, süpernatant atın ve nitrit ölçümü için kullanmak ya da hazırlanmış örnekleri dondurma.
      Not: Nitrit hızla reakan yapıcı nitrat oksihemoglobin (oxyHb) ile cts. oxyHb her nitrit üzerinde daha büyük miktarda mevcut olduğu için, bu reaksiyon, 10 dakika aralığında bir süre ile ana kan nitrit neredeyse tamamen yok olmasına yol açar. endojen kan nitrit en korumak amacıyla, nitrit koruyucu çözelti hemen kan alımından sonra tam kan numuneleri ilave edilir. Çözelti hızla kimyasal nitrit ile reaksiyona girmeyen hemoglobin etkin olmayan bir biçimi, kırmızı kan hücrelerinin lize edildi ve methemoglobin (metHb) içine oxyHb okside olur.
3. Diğer türlü vücut sıvısı örneklerinin hazırlanması
   1. Uygun bir kap içine numune toplama sonra, nitrit koruyarak çözüm, deproteinate ile iyice karıştırın ve hemen ölçmek veya -80 ° C'de dondurulması ve depolanması.
4. Toplama ve doku örneklerinin hazırlanması
   1. heparinize tuzlu su çözeltisi (10 U HEPA ile perfüze hayvanlardan dokuları toplayınrin / ml). istenen dokuya tüketim 1 g homojen ya elle homojenleştirici veya otomatik homojenleştirici kullanılarak.
   2. düz Homojenat elde etmek için gerektiği kadar çözelti koruyucu nitrit bilinen miktarda ekleyin.
   3. 15 dakika boyunca 4 ° C 'de yukarıda tarif edildiği gibi (2 oranı hacim / hacim Örnek / metanol: 1 ya da 1: 1), 13000 x g hızında daha sonra santrifüj örnekleri dokusu homojenize sonra soğuk metanol kullanılarak proteinlerin çökeltilmesi.
   4. süpernatant ve tedbir nitrit seviyelerini toplayın. Gerekirse, -80 ° C'de kuru buz ve mağaza hazırlık herhangi bir aşamasında örnekleri dondurma.

Çözümler Azaltma 2. Hazırlık

1. Tri-iyodür (I ₃₎ nitrit ve R (x) = NO türlerinin tespiti ^1,3,4 çözüm indirgeme
   1. Su içinde 138 mM I ₂ çözeltisi ile birlikte 301 mM KI bir çözelti hazırlayın. Tüm kadar ~ 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde 7 oranında (hacim / hacim çözeltisi / asit): 2, buzlu asetik asit ile karıştırınKristaller eritilir. Tercihen iyodür ışığa duyarlı olarak, karanlık şişe tutmak ve hazırlık itibaren bir hafta içinde kullanın.
      Not: Bu çözüm NO içine Nitrit azaltacak ve aynı zamanda R-SNO, R-nHayır ve Fe-NO fonksiyonel gruplar (R (X) = NO) NO yayınlayacak, ancak nitrat etkilenmeyecektir. Yukarıdaki NO bazlı fonksiyonel grup sinyal asitleştirilmiş sülfanilamid (AS) ve AS-muamele karşılaştırılması ve işlenmemiş sinyal ile numunenin yarısının işlenerek gerçek nitrit sinyalinden ayrılabilir. Geri dönülmez bir şekilde nitrit ile diazonyum katyonu oluşturan ve bu kompleks bir ₃ çözeltisi ile indirgenemez. AS tedavisi için, 1 M HCl in sülfanilamid 290 mM'lik çözelti hazırlayın ve 1 oranında örneğinin bir bölümüne ekleyin: 9 (h / h AS / numune). örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen bölgelerinde CL sinyali ölçer. örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen kısmının bir fark olarak, gerçek nitrit sinyali hesaplayın. Nitrit, aynı zamanda, seçici bir NIT kullanılarak ölçülebilirayin indirgeyici parça 2.2 de tarif edildiği gibi, askorbik / asetik asit karışımı çözeltisi. Bununla birlikte, -NO tür mevcut R- (X) genellikle az miktarda AS işlenmemiş numuneler kullanılarak ölçümler toplam nitrit çok iyi bir yaklaşım çoğu durumda bağlı.
2. Nitrit ² seçici belirlenmesi için askorbik asit / asetik asit (4A) çözeltisi
   1. su içinde 500 mM askorbik asit hazırlayın. Reaksiyon karışımı hazırlamak için 7 (h / h, askorbik asit / asetik asit): bir oranda 1 buzlu asetik asit ile çözelti karıştırın.
      Not: Bu çözelti, nitrit için spesifik olan, herhangi bir R (x) = NO türlerinin ya da nitrat NO bırakmayacaktır. askorbik asit, kolay bir çözelti içinde okside Ancak, askorbik ve asetik asit solüsyonu, her gün ölçümleri yapılmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
      nitrit azaltma tamamlanması askorbik asit konsantrasyonuna bağlıdır; ve en az 50 mm askorbik asit, tam bir R önerilirPlazma nitrit eduction. Bununla birlikte, önceki son örnek ölçümleri beklenen nitrit konsantrasyon aralığında, askorbik asit ve nitrit standartları farklı konsantrasyonları ile birkaç pilot deneyleri için tavsiye edilir. askorbik asit biraz ölçümler sırasında tüketir unutmayın, cam reaksiyon odasındaki reaksiyon karışımının çok sık değişiklikler tavsiye edilir.
3. Nitrat belirlenmesi ⁹ Vanadyum (III) klorid indirgeme çözeltisi
   1. 1 M HCl içinde VCL ₃ 51 mM çözeltisi hazırlayın. Karanlık bir şişe 200 mikron filtre ve mağaza üzerinden filtre çözümü, iki hafta içinde kullanın.
      Not: Bu çözüm nitrat, nitrit ve tüm R (X) = NO türleri azaltacaktır, böylece hesaplanacak nitrit veya diğer R- kıyaslanabilir miktarda (X) = NO türlerinin beraberce nitrat ile mevcut, son nitrat içeriği varsa vcl ₃ ve I elde edilen CL sinyalleri arasındaki fark olarak₃ çözüm azaltır.

3. Kemilüminesans (CL) Çözümleyici Kurulumu ve Ölçümler

1. Standart çözüm
   1. Sodyum nitrit 1 mcM çözeltisi (NaNO ₂₎ hazırlayın. Aynı çözelti, nitrit ve nitrat belirlemeleri için kullanılabilir.
2. YOK analizörü kullanarak
   Not: Şu anda biyolojik araştırma amaçlı yeterince duyarlı iki piyasada mevcut hiçbir analiz vardır - Sievers NOA ve Ecophysics CLD 88Y. Her ikisi de aynı prensiple çalışır; Temel fark, CLD 88Y ozon yapmak için oda havadan oksijen kullanır (O _3), NOA, bu amaç için bir dış oksijen tankı gerektiren ise. Aşağıdaki prosedür Sievers NOA için setini açıklar.
   1. enstrüman kurulum
      1. üretici tavsiyelerine göre YOK analizör ilk kurulum gerçekleştirinolarak Şekil 1'de görülen.
      2. Cihaza bağlı Açık O ₂ tankı. "Analizi" seçin ve ön paneldeki ana menüden "enter". Bir sonraki ekranda seçim "start" basın "girin." Şekil 1 'de görüldüğü gibi, cihaza (1 M NaOH içeren) asit tuzak bağlayın.
      3. photomultiplier -12 ° C'nin altında sıcaklığa soğur ve reaksiyon haznesi 6 Torr tahliye kadar bekleyin. Istikrarlı bir düz taban çizgisini ulaşmak için yaklaşık 30 dakika sürer. Bazal 1 içinde stabilize ihtiyacı - 2 mV, nominal değeri istikrarı daha az önemlidir.
         Not: nitrat ölçülür, soğutma (asit ve su buharları gibi soğuk tuzak hizmet veren 4 ° C'de set) su banyosu ve ısıtma suyu banyosu (ana reaksiyon haznesi, 95 ° C) açın. Vcl ₃ çözeltide içine nitrat indirgeme oranı sıcaklığa bağlıdır ve bu oda Tempe çok yavaşrature, sıcaklık bu nedenle önemli bir artış reaksiyon gözlemlemek için gereklidir.
      4. O tankı açın ve Şekil 1'de görüldüğü gibi asit tuzak cam reaksiyon odasına bağlayın. Uygun indirgeme çözeltisi ile reaksiyon haznesine doldurmak minimuma kabarcık oluşumunu azaltmak ve asit yakalamak için, reaksiyon odası bağlayın. deneme ve yanılma yöntemiyle, enstrüman emme oranı (Siever en NOA için genellikle ~ 200 ml / dk) eşleşecek O köpürme oranını ayarlayın.
      5. Cihazı kontrol Bilgisayarı açın ve Labview tabanlı sıvı yazılımını başlatın. alet ve satın alma yazılımı, basın arasındaki iletişim açmak için ekran okuyana kadar "veri menüsünden" in "çıkış aktif", o zaman "net" tuşuna veri ekranına geri dönmek için "enter".
      6. Ekranda istikrarlı bir temel iz bekleyin ve septum yoluyla çözüm azaltarak içine örnekleri ve nitrit standartlarını enjekte başlar. Her zaman istikrarlı bir temel kıç ulaşmak için sabırsızlanıyorumzirveye er. Bu 2 dakika kadar sürebilir. Sıvı yazılım enjeksiyon bir seçenek için "işareti" kat vardır ve enjeksiyon açıklama ve veri dosyası (filename.data) için yararlı bir tamamlayıcısı olarak ayrı bir dosya (filename.info) içine bu yorumları ihraç edecek.
      7. Numuneler ve standartlar ölçülür kez, seçim Sıvı yazılım menüsünde "dur" - bu "filename.data" olarak bilinen kalıcı bir dosyaya geçici bir dosyaya veri yazar. Basmak "iptal" seçeneği kalıcı dosyaya edinilen verileri yazmadan ölçüm sonlanacaktır.
      8. Deney sona reaksiyon kabının üzerine musluğunu kapatarak reaksiyon kabından makine kesin ve asit tutucu ve reaksiyon kabı arasındaki boru bağlantısını kesmek için (Şekil 1 e bakınız). Şimdi NOA analizörü durdurmak - Basın "net", "bekleme" ve "onayla" bekleme makineyi koymak "analiz", gidin. Düzenli olarak kullanıldığındaenstrüman birkaç hafta bekleme modunda kalabilir. oksijen kaynağını kapatın. Daha sonra reaksiyon haznesi, kesmek gelen azaltılması çözüm yıkayın ve cam reaksiyon kabından O tankı kapatın ve reaksiyon kabı temizliği bitirmek.
   2. Standartlar ve örnek enjeksiyonları
      1. iyi yıkandı, Hamilton şırıngası kullanarak reaksiyon karışımı içerisindeki 1 uM nitrit çözeltisinin 50 ul enjekte edilir. piklerin iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak için enjeksiyonlar arasında 2 dakika - en az 1 bekleyin. 50 ul enjeksiyon tekrarlayın her bir veri noktasına kopyalarını elde etmek. Her enjeksiyondan sonra, iyonu giderilmiş su ile şırınga yıkayın.
      2. 1 uM nitrit çözeltisi 100, 150 ul yinelenen enjeksiyonları ile devam standart eğri için veri tam set elde etmek için (nitrit veya nitrat yüksek konsantrasyonlarda bekleniyor, ek 200 ul gerektirir). Her durumda, sinyal başlangıca geri düşene kadar beklemek özen ve sonra 1 kazanmak - 2 milBaşlangıçta n zirvelerinden iyi ayrılmasını sağlamak için.
         Not: Nitrit standartları deneyler sırasında herhangi bir zamanda ölçülebilir. Ayrıca, gösterge işlevselliği bağımsız bir kontrol olarak hizmet eder Ancak, veri ölçümü önce standart bir eğri elde etmek için tercih edilir.
         verilerin toplandığı zaman, numune miktarı iyi telaffuz zirveleri gitmelidir enjekte edilir. Ancak photomultiplier, sadece ~ 800 mV kadar doğrusal olduğu akılda tutulmalıdır böylece zirve hiçbiri ~ 700 mV daha yüksek olmalıdır. Bu miktar enjekte numunenin azaltılması ya da deiyonize su ile örnek seyreltilmesi yoluyla elde edilebilir. Her bir nokta iki kez, en azından ölçülmelidir.

Sonuçlar

Şekil 2, standart ve beş farklı numune toplanmıştır Örnek sonuçlarını gösterir. Bu Şekilde gösterildiği gibi, photomultiplier gerilim artar nitrit içeren çözelti (standartları veya numune) çözümü azaltılması enjekte edilir hemen sonra başlangıç ​​değerine ve getiri enjekte kez tüm nitrit mevcut (enjeksiyon kez kırmızı eğrinin altında oklarla gösterilir) çözelti düşürülmüştür. Ayrıca, doğru hacim ölçümü yüksek tekrarl...

Tartışmalar

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

orijinal numune hazırlanması, seyreltik ya da tedavi etmek için kullanılabilir (su dahil) çözeltiler alikoları kaydedilmesi gerekir ve olası nitrit ya da (daha çok) nitrat kirlenme kontrol etti. Çoğu kirlenme su gelir ve bir çok kimyasal endojen nitrat belirlenmesine müdahalede bulunan bir çok nitrat kirlilik önemli bir miktarını ihtiva örnek (özellikle ferrisiyanür) tedavisinde kullanılan bulundu. Biz düzenli deneyde kullanmadan ön...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics