Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

Riepilogo

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Abstract

L'ossido nitrico (NO) è una delle principali molecole regolatore dell'omeostasi vascolare e anche un neurotrasmettitore. Enzimatica prodotta NO viene ossidato in nitriti e nitrati dalle interazioni con diverse proteine ​​ossi-eme e altri percorsi ancora poco conosciuti. Il processo inverso, la riduzione dei nitriti e nitrati in NO era stato scoperto nei mammiferi negli ultimi dieci anni ed è guadagnando attenzione come uno dei possibili percorsi per sia prevenire o alleviare una vasta gamma di malattie cardiovascolari, malattie metaboliche e muscolari che si pensa essere associato con diminuzione dei livelli di NO. È quindi importante valutare la quantità di NO e suoi metaboliti in differenti compartimenti corporei - sangue, fluidi corporei e vari tessuti. Sangue, grazie alla sua facile accessibilità, è il vano preferito utilizzato per la stima dei metaboliti. A causa della sua breve vita (pochi millisecondi) e bassa concentrazione di sub-nanomolari, misurazioni affidabili dirette di sangue NO <em> in vivo presentano grandi difficoltà tecniche. Così NO disponibilità è solitamente stimato in base alla quantità dei suoi prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Questi due metaboliti vengono sempre misurati separatamente. Ci sono diversi metodi ben stabiliti per determinare le loro concentrazioni nei fluidi e nei tessuti biologici. Qui vi presentiamo un protocollo per il metodo chemiluminescenza (CL), in base alla rilevazione spettrofotometrica di NO dopo nitriti o nitrati riduzione di (III) soluzioni di cloruro rispettivamente tri-ioduro o vanadio,. La sensibilità per nitriti e nitrati rilevamento è in gamma bassa nanomolari, che stabilisce CL come il metodo più sensibile attualmente disponibile per determinare le variazioni di NO vie metaboliche. Vi spieghiamo in dettaglio come preparare campioni di fluidi e tessuti biologici al fine di preservare quantità originali di nitriti e nitrati presenti al momento della raccolta e su come determinare le loro rispettive quantità nei campioni. Limitazioni della tecnica CL sono anche explained.

Introduzione

Nitrito, e ad un nitrato meno estendere, i livelli nel sangue riflettono stato generale del corpo NO metabolismo. concentrazione dei nitriti nel sangue e la maggior parte degli organi e tessuti sono solo in alta nanomolari o gamma micromolare basso, il nitrato di solito è presente in quantità molto più elevate - nella gamma micromolare. I cambiamenti nei livelli di nitriti a causa di progressione della malattia o cambiamenti nelle abitudini alimentari sono piuttosto piccole e possono essere misurati solo con un metodo molto sensibile. A causa delle loro molto diversi livelli e diversi processi metabolici, la determinazione separata dei livelli di nitriti e nitrati è essenziale. La cosiddetta "NO determinazione _x" dove nitriti e nitrati siano misurate insieme ha ben poco valore.

Diversi metodi per quantificare nitriti in vari campioni biologici sono stati sviluppati - il più comune è il più antico, basato sulla reazione di Griess che era stato originariamente descritto in 1879. Anche con modificatio modernans, il limite di sensibilità per i nitriti ottenibile con il metodo di Griess 'è nella gamma micromolare bassa. Chemiluminescenza (CL), in combinazione con tri-ioduro riducendo soluzione, è attualmente considerato il metodo più sensibile, che consente la quantificazione in gamma bassa nanomolari della concentrazione di nitriti ^1-8,10,11. Lo stesso metodo CL, combinato con vanadio (III) cloruro di riduzione soluzione, può essere utilizzato per misurazioni sensibili di nitrato, con precisione nell'intervallo nanomolare ^9.

CL rileva libera gas NO. Pertanto, nitriti, nitrati, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosamine (R-NNO), o composti metallo-NO (più tardi nel manoscritto di cui come "R- (X) -NO"), deve essere convertito in liberare gas NO al fine di quantificare il loro valore originale via CL. La conversione in NO viene effettuata mediante diverse soluzioni riducenti diversi, a seconda della natura del NO metabolita. Dopo la conversione, libera gas NO viene estratta dal recipiente di reazione da un gas carrier (He, N2 o Ar) nella camera di reazione di CL analizzatore cui l'ozono (O ₃₎ è combinato con NO per formare biossido di azoto (NO ₂₎ nel suo stato attivato. Con il ritorno allo stato fondamentale, NO ₂ * emette nella regione infrarossa e fotone emesso viene rilevato da fotomoltiplicatore (PMT) dello strumento CL. L'intensità della luce emessa è direttamente proporzionale alla concentrazione di NO in camera di reazione, che permette di calcolare la concentrazione della specie originali usando curve di taratura adeguate.

Nel nostro protocollo, in primo luogo abbiamo presente determinazione CL a base di nitriti e nitrati nelle situazioni cliniche più utilizzate - nel sangue e di plasma, e poi discutiamo come determinare questi ioni in campioni di tessuto. Spiegheremo anche nel dettaglio come preservare la concentrazione di nitrito fisiologica originale in ambienti nitriti reattivo, come il sangue e suoi scomparti, plasma e globuli rossi.

Protocollo

Tutti i protocolli, tra cui l'uso di animali sono stati approvati per l'uso da NIDDK cura degli animali e del Comitato uso e sangue umano è stato ottenuto da banca del sangue NIH da donatori sani.

Preparazione 1. Esempio

1. Preparazione della soluzione di nitrito di conservazione
   1. Preparare una soluzione contenente 890 mM ferrocianuro di potassio (K ₃ Fe (CN) ₆₎ e 118 mM NEM (N-etilmaleimide) in acqua distillata. Sciogliere bene fino a quando è chiaro di colore giallo, senza cristalli presenti. Aggiungere NP-40 (ottil phenoxylpolyethoxylethanol) in un rapporto 1: 9 (v / v, NP-40 / soluzione). Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e conservare a 4 ° C per circa una settimana).
2. Raccolta e preparazione dei campioni di sangue
   1. Raccogliere il sangue utilizzando almeno un ago 20 G per evitare emolisi con eparina per prevenire la coagulazione (5 U / ml). Per il campione di sangue intero, mescolare il sangue con nitrito di conservazione immediatamente soluzione in un rapporto 1: 4 (v/ V / sangue).
   2. Per i campioni di plasma e globuli rossi, centrifugare il sangue raccolto per 5 minuti a 4000 xga 4 ° C per separare i globuli rossi (RBC) e plasma. Prendere il surnatante (plasma) e mescolare con nitrito di preservare soluzione come sopra descritto per la determinazione dei livelli di nitriti nel plasma.
   3. Rimuovere accuratamente plasma e buffy coat dal campione e pipetta RBC dal fondo del tubo rimanente per evitare la contaminazione da altri tipi di cellule del sangue utilizzando un puntale cut-off, e trasferirlo in una provetta contenente nitriti soluzione conservando nello stesso rapporto come sopra.
   4. Mescolare ogni campione (plasma e RBC) con metanolo freddo ad un rapporto 1: 1 o 1: 2 (v / v campione / metanolo) e centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 minuti per precipitare le proteine. Prendere il surnatante e utilizzarlo per la misurazione nitriti o congelare campioni preparati, se necessario, il ghiaccio secco e conservare a -80 ° C.
      Nota: Nitrito rea rapidamenteCTS con ossiemoglobina (oxyHb) nel sangue formare nitrati. Poiché oxyHb è sempre presente in grande eccesso rispetto nitrito, questa reazione porta alla distruzione quasi completa del nitrito di sangue nativo con un arco di tempo di ~ 10 min. Per preservare la maggior parte endogena nitrito di sangue, soluzione di nitrito-conservazione viene aggiunto ai campioni di sangue intero immediatamente dopo il prelievo di sangue. La soluzione rapidamente lisare i globuli rossi e ossidare oxyHb in metaemoglobina (metHb), una forma inattiva di emoglobina che non reagisce chimicamente con nitriti.
3. Preparazione dei campioni da altri tipi di fluido corporeo
   1. Dopo la raccolta del campione in apposito contenitore, mescolare bene con nitrito di preservare soluzione, deproteinate e misurare immediatamente o congelare e conservare a -80 ° C.
4. Raccolta e preparazione dei campioni di tessuto
   1. Raccogliere tessuti provenienti da animali perfusi con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U HEPArin / ml). Excise circa 1 g di tessuto desiderata e omogeneizzare sia utilizzando un omogeneizzatore manuale o automatizzato omogeneizzatore.
   2. Aggiungere quantità nota di nitrito preservare soluzione come necessario per conseguire omogenato liscia.
   3. Una volta che il tessuto è omogeneizzato, precipitare le proteine ​​usando metanolo freddo (1: 1 o 1: 2 rapporto v / v campione / metanolo) come sopra descritto, campioni quindi centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 min.
   4. Raccogliere i livelli di nitriti surnatante e misura. Se necessario, congelarli a qualsiasi fase di preparazione in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C.

2. Preparazione di Riduzione Solutions

1. Tri-ioduro (I ₃₎ ridurre la soluzione per nitriti e R- (X) NESSUN specie determinazione ^1,3,4
   1. Preparare una soluzione di 301 mM KI insieme a 138 mm I ₂ soluzione in acqua. Mescolare con acido acetico glaciale in rapporto 2: 7 (v / v / soluzione acida) su un agitatore magnetico per ~ 30 minuti fino a quando tutticristalli sono dissolti. Preferibilmente tenere in bottiglia scura, come ioduro è sensibile alla luce, ed utilizzare entro una settimana dalla preparazione.
      Nota: Questa soluzione consentirà di ridurre il nitrito in NO e sarà anche rilasciare NO da R-SNO, R-NNO e Fe-no gruppi funzionali (R- (X) -NO), ma il nitrato non sarà influenzata. Il segnale dai gruppi funzionali sopra NO-based può essere separato dal segnale vero nitriti mediante trattamento di metà del campione con sulfanilamide acidificato (AS) e confrontando AS-trattati e il segnale non trattato. Forme come irreversibilmente diazonio cazione con nitriti e questo complesso può essere ridotta I ₃ soluzione. Per AS trattamento, preparare 290 soluzione mM di Sulfanilamide in 1 M HCl e aggiungerlo a una aliquota di campione in rapporto 1: 9 (v / v AS / campione). Misurare il segnale CL in parti AS-trattati e non trattati del campione. Calcolare il segnale vero nitriti come una differenza di parte AS-trattate e non trattate di campione. Il nitrito può essere misurato anche utilizzando un NIT selettivoRite-riducendo soluzione di miscela di acido ascorbico / acido acetico, come descritto nella parte 2.2. Tuttavia, a causa della piccola quantità di solito di R- (X) -NO specie presenti, misurazioni utilizzando campioni AS-trattati sono nella maggior parte dei casi una buona approssimazione del tenore totale di nitriti.
2. Acido ascorbico / acido acetico soluzione (4A) per la determinazione selettiva di nitriti ²
   1. Preparare 500 mm acido ascorbico in acqua. Mescolare questa soluzione con acido acetico glaciale in un rapporto 1: 7 (v / v, acido ascorbico / acido acetico) per preparare la miscela di reazione.
      Nota: Questa soluzione è specifica per il nitrito, non rilascerà NO da qualsiasi R- (X) NESSUN specie o nitrato. Tuttavia, la soluzione di ascorbico e acido acetico deve essere preparata estemporaneamente ogni giorno prima delle misurazioni, come acido ascorbico ossida facilmente in soluzione.
      Il completamento della riduzione nitriti dipende dalla concentrazione di acido ascorbico; e almeno 50 mM di acido ascorbico è raccomandato completa reduction di nitriti plasma. Tuttavia, si consiglia di eseguire alcuni esperimenti pilota con diverse concentrazioni di acido ascorbico e gli standard di nitriti nel range di concentrazione di nitriti previsto prima misurazioni campione finale. Tenere presente che l'acido ascorbico esaurisce leggermente durante le misurazioni, sono raccomandati così frequenti cambi di miscela di reazione nella camera di reazione di vetro.
3. Vanadio (III) riducendo soluzione di cloruro di determinazione nitrato ⁹
   1. Preparare 51 mM soluzione di VCl ₃ in 1 M HCl. soluzione filtro attraverso il filtro 200 micron e conservare in una bottiglia scura, utilizzare entro due settimane.
      Nota: Questa soluzione ridurrà nitrati, nitriti e tutti R- (X) -NO specie, quindi se quantità comparabili di nitriti o altro R- (X) -NO specie sono presenti insieme con nitrato, il contenuto finale nitrati deve essere calcolato come la differenza tra i segnali CL ottenuti con VCl ₃ e₃ riducendo soluzioni.

3. chemiluminescenza (CL) Setup Analyzer e Misure

1. Soluzione standard
   1. Preparare 1 mM soluzione di nitrito di sodio (nano _2). La stessa soluzione può essere utilizzata per nitriti e nitrati determinazioni.
2. Utilizzando analizzatore
   Nota: Attualmente ci sono due disponibili in commercio NO analizzatori che sono abbastanza sensibili per finalità di ricerca biologica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Entrambi operano sullo stesso principio; la differenza principale è che CLD 88Y utilizza l'ossigeno dall'aria camera per rendere ozono (O _3), mentre NOA richiede un serbatoio di ossigeno esterna a questo scopo. La procedura che segue descrive il set up per il Sievers NOA.
   1. configurazione dello strumento
      1. Eseguire la configurazione iniziale del analizzatore secondo le raccomandazioni del fabbricantecome visto in Figura 1.
      2. Aprire serbatoio O ₂ collegato allo strumento. Scegliere "analisi" e "inserire" dal menu principale del pannello frontale. Nella schermata successiva scegliere "start" e premere "invio". Collegare la trappola di acido (contenente 1 M NaOH) allo strumento come mostrato in Figura 1.
      3. Attendere fotomoltiplicatore raffredda alla temperatura inferiore a -12 ° C e la camera di reazione viene evacuato a 6 Torr. Ci vogliono circa 30 minuti per raggiungere una linea di base piana e stabile. La linea di base deve stabilizzare entro 1 - 2 mV, il suo valore nominale è meno importante della sua stabilità.
         Nota: Se il nitrato è misurato, accendere il bagno di raffreddamento ad acqua (a 4 ° C, che serve trappola fredda per vapori acidi e acqua) e bagno di acqua di riscaldamento (camera di reazione principale, 95 ° C). Il tasso di riduzione dei nitrati in NO in VCl ₃ soluzione dipende dalla temperatura, ed è molto lento a camera temperatura, è necessario in modo sostanziale aumento della temperatura per osservare la reazione.
      4. Aprire il serbatoio Lui e collegare la camera di reazione di vetro per intrappolare acido come visto in Figura 1. Riempire la camera di reazione con soluzione riducente adeguata, ridurre il gorgogliare al minimo e connettersi camera di reazione alla trappola di acido. Utilizzando tentativi ed errori, regolare la velocità di ribollimento Egli per abbinare il tasso di aspirazione strumento (di solito ~ 200 ml / min per NOA di Siever).
      5. Accendere il computer che controlla lo strumento e avviare il software Liquid Labview-based. Per attivare la comunicazione tra lo strumento e il software di acquisizione, premere "Invio" quando nel menu "Dati" fino a schermo si legge "in uscita abilitato", quindi premere "chiaro" per tornare indietro alla schermata dei dati.
      6. Attendere una traccia linea di base stabile sullo schermo e iniziare l'iniezione di campioni e gli standard di nitrito in riducendo soluzione attraverso il setto. Attendere sempre per raggiungere una linea di base stabile a poppaer il picco. Questo può richiedere fino a 2 min. Il software Liquid ha un'opzione per "marcare" i tempi di iniezione e annotare l'iniezione e sarà esportare questi commenti in un file separato (filename.info) come un utile complemento per il file di dati (filename.data).
      7. Una volta che i campioni e gli standard sono misurati, scegliere "stop" opzione nel menu del software Liquid - questo scriverà i dati da un file temporaneo in un file permanente conosciuto come "filename.data". Premendo l'opzione "abortire" terminerà la misurazione senza scrivere dati acquisiti in un file permanente.
      8. Per terminare esperimento, scollegare la macchina dal recipiente di reazione spegnendo il rubinetto sulla parte superiore del recipiente di reazione e scollegare il tubo tra trap acidi e recipiente di reazione (vedere Figura 1). Ora smettere analizzatore NOA - premere "chiaro", andare a "analisi", mettere la macchina in "stand-by" e stand-by "conferma". Se usato regolarmente, ilstrumento può essere lasciato in modalità stand-by per diverse settimane. Spegnere rifornimento di ossigeno. Poi lavare la soluzione riducendo dalla camera di reazione, scollegare e chiudere il serbatoio Egli dal recipiente di reazione di vetro e rifinire recipiente di reazione.
   2. Norme e iniezioni di esempio
      1. Iniettare 50 ml di soluzione di nitrito di 1 micron in miscela di reazione con una siringa Hamilton ben lavata. Attendere almeno 1 - 2 min tra le iniezioni per ottenere una buona separazione dei picchi. Ripetere l'iniezione di 50 ml per ottenere i duplicati per ogni punto di dati. Lavare la siringa con acqua deionizzata dopo ogni iniezione.
      2. Per acquisire una serie completa di dati per curva standard, continuare con iniezioni duplicate di 100, 150 ml (altri 200 ml potrebbero essere necessari se si prevedono elevate concentrazioni di nitriti e nitrati) di soluzione di nitrito di 1 micron. In ogni caso, aver cura di attendere che il segnale scende di nuovo alla linea di base e quindi acquisire 1 - 2 min di base per ottenere una buona separazione dei picchi.
         Nota: standard nitriti possono essere misurati in qualsiasi momento durante gli esperimenti. Tuttavia, è preferibile acquisire la curva standard prima della misurazione dei dati, in quanto serve anche come un controllo indipendente della funzionalità dello strumento.
         Quando i dati sono raccolti, quantità di campione iniettata dovrebbe portare a picchi ben pronunciate. Tuttavia va tenuto presente che il fotomoltiplicatore è lineare solo fino a ~ 800 mV, quindi nessuno del picco deve essere superiore a ~ 700 mV. Ciò può essere ottenuto sia diminuendo di campione quantità iniettata o diluendo il campione con acqua deionizzata. Ogni punto dovrebbe essere misurata almeno in doppio.

Risultati

La figura 2 mostra i risultati rappresentativi raccolti da standard e cinque campioni diversi. Come mostrato in questa figura, tensione aumenta fotomoltiplicatore immediatamente dopo nitrito contenenti soluzione (standard o campioni) viene iniettato riducendo soluzione (iniezioni volte sono indicati da frecce rosse sotto la curva) e ritorna al valore basale volta tutte nitriti presenti nella iniettato soluzione è stata ridotta. È anche chiaro da questa figura che sono ...

Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo

Aliquote di tutte le soluzioni (tra cui l'acqua) usate per preparare, diluire o altrimenti trattare campioni originali devono essere salvati e controllati per possibili nitriti o (più spesso) contaminazione da nitrati. Abbiamo trovato che la maggior contaminazione proviene da acqua e molti prodotti chimici usati per il trattamento di campioni (ferricianuro in particolare) contengono anche significativa quantità di contaminazione da nitrati...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics