Измерение нитритов и нитратов, метаболиты в оксид азота Pathway, в биологических материалах с использованием метода хемилюминесценции

Резюме

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Аннотация

Оксид азота (NO), является одним из основных молекул регулятора в сосудистом гомеостазе, а также нейромедиатор. Ферментативно NO окисляется до нитритов и нитратов в результате взаимодействия с различными кислородно-гема белков и других до сих пор не очень хорошо известных путей. Обратный процесс, восстановление нитрита и нитрата в NO были обнаружены у млекопитающих, в последнее десятилетие, и все большее внимание привлекает как один из возможных путей, чтобы предотвратить или облегчить целый ряд сердечно-сосудистых, метаболических и мышечных расстройств, которые, как полагают, быть связано со снижением уровня NO. Поэтому важно, чтобы оценить количество NO и его метаболитов в различных отсеках тела - кровь, жидкости организма и различных тканей. Кровь, из-за его легкой доступности, является предпочтительным отделение используется для оценки NO метаболитов. Из-за короткого времени жизни (несколько миллисекунд) и низкой концентрации к югу от наномолярной, прямых надежных измерений крови NO <EM> в естественных условиях нынешних больших технических трудностей. Таким образом НЕТ Наличие не обычно оценивается на основе количества продуктов его окисления, нитритов и нитратов. Эти два метаболита всегда измеряются отдельно. Есть несколько хорошо известных методов для определения их концентрации в биологических жидкостях и тканях. Здесь мы приводим протокол для метода хемилюминесценции (CL), на основе спектрофотометрического обнаружения NO после нитритов или нитратов сокращения на три-йодида или ванадия (III) хлоридных растворов, соответственно. Чувствительность к нитритов и обнаружения нитратов находится в низком диапазоне наномолярной, который устанавливает CL как наиболее чувствительный метод имеющихся в настоящее время для определения изменений в NO метаболических путей. Мы подробно объяснить, как подготовить образцы из биологических жидкостей и тканей с целью сохранения первоначальных количеств нитрита и нитрата в настоящее время сбора и как определить их соответствующие суммы в образцах. Ограничения метода CL также ехржаловались,.

Введение

Нитриты и менее продлить нитратов, уровни в крови не отражают общее состояние организма NO метаболизм. концентрации нитрита в крови и большинство органов и тканей только в высокой наномолярной или низком диапазоне микромолярном, нитратов обычно присутствует в гораздо больших количествах - в микромолярном диапазоне. Изменения в уровнях нитритов вследствие прогрессирования заболевания или изменения привычек питания достаточно малы и могут быть измерены только с помощью очень чувствительный метод. Из-за их самых разных уровней и различных метаболических процессов, раздельное определение нитритов и нитратов уровней имеет важное значение. Так не называется "NO определения _х" , где нитритов и нитратов измеряются вместе имеет очень мало значения.

Было разработано несколько методов количественного определения нитрита в различных биологических образцах - наиболее распространенным является самой старой, основанный на реакции Грисса, которые были первоначально описанной в 1879. Даже с современной modificatioнс, предел чувствительности для нитрита достижимый методом Грисс 'находится в низком диапазоне микромолярном. Хемилюминесценции (ХЛ), в сочетании с три-йодид раствора восстанавливающего, в настоящее время считается наиболее чувствительным методом, что позволяет количественно оценить в низком диапазоне наномолекулярных концентрации нитрита ^1-8,10,11. Тот же метод CL, в сочетании с ванадий (III) , хлорид раствора восстанавливающего, могут быть использованы для чувствительных измерений нитратов, с точностью в диапазоне наномолярной ^9.

CL обнаруживает свободный газ NO. Поэтому, нитриты, нитраты, R-нитрозотиолы (R-SNO), R-нитрозоамины (R-нно), или соединения металла NO (далее в рукописи упоминается как "R- (X) -NO"), должны быть преобразованы в бесплатно без газа для того, чтобы количественно оценить свои первоначальные суммы через CL. Преобразование в NO достигается с помощью нескольких различных восстанавливающих растворов, в зависимости от характера NO метаболита. После преобразования, свободный газ не удаляется из реакционного сосуда с помощью газа-носителя (He, N2 или Ar) в реакционную камеру анализатора CL , где озон (O ₃₎ в сочетании с NO с образованием диоксида азота (NO ₂₎ в активированном состоянии. С возвращением в основное состояние, NO ₂ * излучает в инфракрасной области спектра и излучается фотон регистрируется ФЭУ (ФЭУ) КЛ инструмента. Интенсивность излучаемого света прямо пропорциональна концентрации NO в реакционной камере, что позволяет рассчитывать концентрацию исходных видов, используя соответствующие калибровочные кривые.

В нашем протоколе мы дадим сначала CL на основе определения нитритов и нитратов в наиболее часто используемых клинических условиях - в крови и плазме, а затем мы рассмотрим, как определить эти ионы в образцах ткани. Мы также подробно объяснить, как сохранить первоначальную физиологическую концентрацию нитритов в нитрит-реактивных средах, таких как кровь и его отделений, плазмы и красных кровяных телец.

протокол

Все протоколы, включая использование животных были одобрены для использования NIDDK уходу и использованию животных комитета и человеческая кровь была получена из банка крови NIH от здоровых доноров.

1. Подготовка образцов

1. Приготовление раствора нитрита с сохранением
   1. Готовят раствор , содержащий 890 мМ феррицианида калия (K ₃ Fe (CN) ₆₎ и 118 мМ NEM (N-этилмалеимид) в дистиллированной воде. Растворите хорошо, пока не станет ясно, желтый, без кристаллов присутствующих. Добавить NP-40 (октил phenoxylpolyethoxylethanol) в соотношении 1: 9 (об / об, NP-40 / раствор). Осторожно перемешать, чтобы избежать пенообразования и хранят при температуре 4 ° С в течение недели).
2. Сбор и подготовка проб крови
   1. Сбор крови с использованием, по меньшей мере, 20 G иглы, чтобы избежать гемолиза с гепарином для предотвращения коагуляции (5 ед / мл). Для получения образца цельной крови, перемешать кровь с нитритом сохранением раствора сразу в соотношении 1: 4 (об/ Об раствора / кровь).
   2. Для получения плазмы и эритроцитов образцов, центрифуга собранную кровь в течение 5 мин при 4000 х г при 4 ° С для отделения красных кровяных клеток (эритроцитов) и плазмы. Возьмем супернатант (плазма) и смешать его с нитритом сохранением раствора, как описано выше, для определения уровня нитритов в плазме.
   3. Осторожно удалить остатки плазмы и поглощающее покрытие из образца и пипетки RBC образца из нижней части трубки, чтобы избежать загрязнения другими типами клеток крови с использованием среза пипетку, и передать его в пробирку, содержащую нитрит сохраняющее раствор в том же самом соотношение, как указано выше.
   4. Смешайте каждого образца (плазмы и эритроцитов) с холодным метанолом в соотношении 1: 1 или 1: 2 (объем / объем пробы / метанол) и центрифугировать их при 13.000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин для осаждения белков. Возьмите супернатант и использовать его для измерения нитритов или заморозить Приготовленные образцы, если это необходимо, на сухом льду и хранят при -80 ° С.
      Примечание: Нитрит быстро ReaКТС с оксигемоглобина (oxyHb) в формировании нитрата крови. Так как oxyHb всегда присутствует в большом избытке над нитрита, эта реакция приводит к почти полное уничтожение родного нитрита крови с временной рамкой из ~ 10 мин. Для того чтобы сохранить большую часть эндогенного нитрита крови, нитритов, сохраняющих раствор добавляют к цельной крови сразу после взятия крови. Раствор быстро лизировать эритроциты и окисляют oxyHb в метгемоглобин (metHb), неактивную форму гемоглобина, который не вступает в химическую реакцию с нитритом.
3. Подготовка образцов из других видов жидкости организма
   1. После взятия пробы в соответствующий контейнер, хорошо перемешать с нитритом сохранением раствора, deproteinate и измерить сразу или заморозить и хранить при температуре -80 ° C.
4. Сбор и подготовка образцов тканей
   1. Собирают ткани от животных увлажненную с гепарином солевым раствором (10 U HEPARin / мл). Акцизной около 1 г желаемой ткани и гомогенизируют либо с помощью ручного гомогенизатора или автоматизированный гомогенизатора.
   2. Добавить известное количество нитрита, сохраняющих решение по мере необходимости для достижения гладкой гомогената.
   3. После того, как ткань гомогенизируют, осадить белки с использованием холодного метанола (1: 1 или 1: 2 соотношение объем / объем образца / метанол), как описано выше, а затем центрифуга образцы при 13.000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин.
   4. Соберите супернатант и измерения уровней нитритов. При необходимости, заморозить образцы на любой стадии приготовления на сухом льду и хранят при -80 ° С.

2. Подготовка решений Снижение

1. Tri-йодид (I ₃₎ раствора восстанавливающего для нитритов и R- (X) -NO видов определения ^1,3,4
   1. Приготовьте раствор 301 мМ KI вместе с 138 ₂ мМ раствора I в воде. Смешать с помощью ледяной уксусной кислоты в соотношении 2: 7 (об / об раствора / кислоты) на магнитной мешалке в течение ~ 30 мин, пока всекристаллы растворяются. Предпочтительно иметь в темную бутылку, как йодид чувствителен к свету, и использовать в течение одной недели с момента приготовления.
      Примечание: Это решение позволит сократить нитрита в NO , и он также выпустит NO из R-SNO, R-NNO и Fe-NO функциональных групп (R- (X) -NO), но нитрат не будут затронуты. Сигнал от вышеуказанных NO на основе функциональных групп могут быть отделены от истинного сигнала нитрита путем обработки половины образца с подкисленной сульфаниламида (AS) и сравнив AS-обработанных и необработанных сигналов. А.С. образуют необратимые диазония катион с нитритом и этот комплекс не может быть уменьшена путем I ₃ раствора. Для лечения AS, подготовить 290 мМ раствора сульфаниламида в 1 М HCl и добавить его к аликвоте образца в соотношении 1: 9 (v / v AS / образец). Измерьте сигнал CL в AS-обработанных и необработанных участках образца. Вычислить истинный сигнал нитрита как разность AS-обработанных и необработанных части образца. Нитрит может быть также измерена с применением селективной нитобряду снижающих раствор аскорбиновой / смеси уксусной кислоты, как описано в части 2.2. Тем не менее, из-за обычно небольшого количества R- (X) -NO присутствующих видов, измерения с использованием в качестве необработанной пробы в большинстве случаев очень хорошее приближение общего содержания нитрита.
2. Аскорбиновая кислота уксусная кислота Раствор / (4A) для селективного определения нитрита ²
   1. Приготовьте 500 мМ аскорбиновой кислоты в воде. Смешайте этот раствор с помощью ледяной уксусной кислоты в соотношении 1: 7 (об / об, аскорбиновая кислота / уксусная кислота) с получением реакционной смеси.
      Примечание: Это решение является специфическим для нитрита, не будет выпускать NO из любого R- (X) -NO видов или нитрат. Тем не менее, раствор аскорбиновой и уксусной кислоты должны быть подготовлены свеже каждый день перед измерениями, как аскорбиновая кислота легко окисляется в растворе.
      Завершение нитрита снижения зависит от концентрации аскорбиновой кислоты; и по меньшей мере 50 мМ аскорбиновой кислоты рекомендуется для полного гОбразование плазменного нитрита. Тем не менее, рекомендуется выполнить несколько пробных экспериментов с различными концентрациями аскорбиновой кислоты и стандартов нитрита в ожидаемом диапазоне концентраций нитритов до окончательных выборочных измерений. Имейте в виду, что аскорбиновая кислота слегка истощает во время измерений, рекомендуется так частые изменения реакционной смеси в реакционной камере стекла.
3. Ванадий (III) , хлорид восстановительный раствор для определения нитратов ⁹
   1. Готовят 51 мМ раствор VCl ₃ в 1 М HCl. Фильтр раствор через фильтр 200 мкм и хранить в темной бутылке, использовать в течение двух недель.
      Примечание: Пониженная нитраты, нитриты и все R- (X) -NO видов, так что, если сравнимые количества нитритов или других R- (X) , -NO виды присутствуют вместе с нитратом, конечное содержание нитратов следует рассчитать как разность между ХЛ сигналами , полученными с VCl ₃ и I₃ сокращения решений.

3. Хемилюминесценция (CL) Analyzer Настройка и Измерения

1. Стандартное решение
   1. Готовят 1 мкМ раствор нитрита натрия (NaNO _2). То же самое решение может быть использовано для нитритов и нитратов определений.
2. НЕ используя анализатор
   Примечание: В настоящее время два коммерчески доступных NO анализаторы , которые являются достаточно чувствительными для биологических целей исследований - Сиверс NOA и Ecophysics CLD 88Y. Они оба работают по тому же принципу; Основное различие заключается в том , что CLD 88Y использует кислород из воздуха в помещении , чтобы сделать озон (O _3), в то время как NOA требуется внешний бак кислорода для этой цели. Приведенная ниже процедура описывает набор вверх для Сиверса НОА.
   1. установка параметров прибора
      1. Выполнение начальной настройки на NO анализатора в соответствии с рекомендациями завода-изготовителякак видно на рисунке 1.
      2. Открыть O ₂ бак подключен к прибору. Выберите "анализ" и "войти" в главном меню на передней панели. На следующем экране выберите "Пуск" и нажмите "Enter". Подключите кислоты ловушку (содержащего 1 М NaOH) к прибору , как показано на рисунке 1.
      3. Подождите, пока ФЭУ не остынет до температуры ниже -12 ° С, и реакционную камеру вакуумируют до 6 мм рт. Она занимает около 30 минут, чтобы достичь стабильного плоской базовой линии. Базовая линия должна стабилизироваться в течение 1 - 2 мВ, его номинальное значение имеет меньшее значение, чем его стабильность.
         Примечание: Если нитрат измеряется, включите ванну охлаждающей воды (устанавливается при 4 ° С, которая служит в качестве охлаждаемой ловушки для паров кислоты и воды) и нагрева водяной бане (основной реакционной камере, 95 ° C). Скорость восстановления нитрата в NO в ₃ растворе Vcl зависит от температуры, и это очень медленно при комнатной Температура, так что значительное повышение температуры необходимо, чтобы наблюдать за реакцией.
      4. Откройте He бак и подключить стеклянную реакционную камеру к кислотной ловушке , как показано на рисунке 1. Наполните реакционную камеру с соответствующим восстанавливающим раствором, уменьшить прорывается к минимуму и соединить реакционную камеру к кислотной ловушке. С помощью метода проб и ошибок, регулировать скорость кипящий он соответствовал скорости всасывания прибора (обычно ~ 200 мл / мин для NOA Сивер в).
      5. Включите компьютер, контролирующий прибор и запустить программное обеспечение Liquid Labview основе. Для включения связи между прибором и программным обеспечением сбора данных, нажмите "ввод", когда в меню "данных", пока экран не читает "включен выход", а затем нажмите кнопку "Очистить", чтобы вернуться к экрану данных.
      6. Дождитесь стабильной базовой линии следа на экране и начать инъекционным образцы и стандарты нитритов в сокращении раствор через перегородку. Всегда ждать, чтобы достичь стабильного базового кормовой частиэр пик. Это может занять до 2 мин. Liquid программное обеспечение имеет возможность «отметить» времена инъекции и аннотирования инъекции, и она будет экспортировать эти комментарии в отдельный файл (filename.info) в качестве полезного дополнения к файлу данных (filename.data).
      7. После того, как образцы и стандарты измеряются, выберите "стоп" опцию в меню Liquid программного обеспечения - это будет записывать данные из временного файла в постоянный файл, известный как "filename.data". Опция При нажатии кнопки "прервать" прекратит измерение без записи полученных данных в постоянный файл.
      8. Для завершения эксперимента, отсоедините машину от реакционного сосуда, отключив запорный кран на верхней части реакционного сосуда и отсоедините трубку между кислотой ловушку и реакционный сосуд (см рисунок 1). Теперь остановить анализатор NOA - нажмите "Очистить", перейдите в раздел "анализ", поставить машину на "ожидания" и "Confirm" в режиме ожидания. Если используется регулярно, тоПрибор может быть оставлен в режиме ожидания в течение нескольких недель. Выключите подачу кислорода. Затем промойте восстанавливающий раствор из реакционной камеры, отсоединить и закрыть He бак из реакционного сосуда и стеклянный По окончании очистки реакционного сосуда.
   2. Стандарты и образцы инъекции
      1. Вводят 50 мкл 1 мкМ раствора нитрита в реакционной смеси с использованием хорошо промытый Гамильтон шприц. Подождите, по крайней мере, 1 - 2 мин между инъекциями, чтобы достичь хорошего разделения пиков. Повторите инъекции 50 мкл, чтобы получить дубликаты в каждой точке данных. Промыть шприц с деионизированной водой после каждой инъекции.
      2. Для получения полного набора данных для стандартной кривой, по-прежнему с повторяющимися инъекциями 100, 150 мкл (дополнительные 200 мкл могут быть необходимы, если высокие концентрации нитритов или нитратов, как ожидается) 1 мкМ раствора нитрита. В каждом случае, позаботиться, чтобы ждать, пока сигнал не падает обратно к базовой линии, а затем приобрести 1 - 2 милип базовой линии для достижения хорошего разделения пиков.
         Примечание: стандарты Нитриты могут быть измерены в любой момент во время экспериментов. Тем не менее, предпочтительно, чтобы приобрести стандартную кривую перед измерением данных, поскольку она также служит в качестве независимой проверки функциональных возможностей прибора.
         При сборе данных, количество образца впрыскивают должно привести к хорошо выраженных пиков. Однако следует иметь в виду, что фотоэлектронный линейна только до ~ 800 мВ, так что ни один из пика не должна быть выше, чем на ~ 700 мВ. Это может быть достигнуто либо за счет уменьшения количества от вводимой пробы или разбавления пробы деионизированной водой. Каждая точка должна быть измерена по крайней мере в двух экземплярах.

Результаты

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты , полученные от стандартов и пяти различных образцов. Как показано на этом рисунке, увеличивается фотоэлектронный умножитель напряжения сразу после того, как нитриты, содержащих раствор (стандарты или пробы) ...

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Аликвоты всех решений (включая воду), используемых для приготовления, разбавленные или иным образом обработать оригинальные образцы должны быть сохранены и проверены на предмет возможного нитрита или (чаще) загрязнение нитратами. Мы о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics