Mesure de nitrites et de nitrates, Métabolites dans le Nitric Oxide Pathway, dans les matières biologiques en utilisant la méthode chimiluminescence

Résumé

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Résumé

L'oxyde nitrique (NO) est l'une des principales molécules de régulation de l'homéostasie vasculaire et aussi un neurotransmetteur. produit enzymatiquement NO est oxydé en nitrites et les nitrates par des interactions avec diverses protéines oxy-hème et d'autres voies encore mal connues. Le processus inverse, la réduction des nitrites et les nitrates en NO avait été découvert chez les mammifères dans la dernière décennie et il est attirer l'attention comme l'une des voies possibles pour prévenir ou soulager toute une gamme de maladies cardiovasculaires, des troubles métaboliques et musculaires qui sont considérés être associée à une diminution des niveaux de NO. Il est donc important d'estimer la quantité de NO et de ses métabolites dans les différents compartiments du corps - du sang, des fluides corporels et des tissus différents. Le sang, en raison de sa facilité d'accès, est le compartiment préféré utilisé pour l'estimation de NO métabolites. En raison de sa courte durée de vie (quelques millisecondes) et une faible concentration sous-nanomolaire, des mesures fiables directes de sang NO <em> in vivo présentent de grandes difficultés techniques. On estime généralement donc pas la disponibilité sur la base du montant de ses produits d'oxydation, nitrites et nitrates. Ces deux métabolites sont toujours mesurées séparément. Il existe plusieurs méthodes bien établies pour déterminer leurs concentrations dans des fluides et tissus biologiques. Ici, nous présentons un protocole de mode de chimioluminescence (CL), basée sur la détection spectrophotométrique de NO après le nitrite ou le nitrate de réduction de triiodure ou de vanadium (III), des solutions de chlorure, respectivement. La sensibilité pour le nitrite et la détection de nitrate est en bas de gamme nanomolaire, qui fixe CL comme la méthode la plus sensible actuellement disponible pour déterminer les changements dans NO voies métaboliques. Nous expliquons en détail comment préparer des échantillons de fluides et les tissus biologiques afin de préserver des quantités initiales de nitrites et de nitrates présents au moment de la collecte et de la façon de déterminer leurs quantités respectives dans les échantillons. Limites de la technique CL sont également explained.

Introduction

Nitrites, et un nitrate moins prolonger, les niveaux dans le sang reflète l'état général du corps NO métabolisme. Les concentrations de nitrites dans le sang et la plupart des organes et des tissus sont uniquement en haute nanomolaire ou bas de gamme micromolaire, le nitrate est généralement présent dans des quantités beaucoup plus élevées - dans la gamme micromolaire. Les variations de taux de nitrite en raison de la progression de la maladie ou des changements dans les habitudes alimentaires sont assez petites et peuvent être uniquement mesurés en utilisant une méthode très sensible. En raison de différents processus métaboliques leurs niveaux très différents et, détermination séparée des niveaux de nitrite et de nitrate est essentiel. Les soi-disant "NO _x détermination" lorsque les nitrites et les nitrates sont mesurées ensemble a très peu de valeur.

Plusieurs méthodes de quantification du nitrite dans divers échantillons biologiques ont été développés - étant le plus commun la plus ancienne, basée sur la réaction de Griess qui avait été décrit à l'origine en 1879. Même avec modificatio modernens, la limite de sensibilité pour le nitrite réalisable par la méthode de Griess de est en bas de gamme micromolaire. Chimiluminescence (CL), combiné avec tri-iodure solution réductrice, est actuellement considérée comme la méthode la plus sensible, permettant la quantification dans le bas de gamme nanomolaire des concentrations de nitrite ^1-8,10,11. La même méthode CL, combinée avec le vanadium (III) , le chlorure solution réductrice, peut être utilisé pour des mesures sensibles de nitrate, avec une précision dans la gamme nanomolaire ^9.

CL détecte gaz libre NO. Par conséquent, nitrite, nitrate, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosamines (R-NNO), ou des composés métal-NO (plus tard dans le manuscrit dénommé "R- (X) -NO"), doivent être convertis en libérer le gaz NO afin de quantifier leur valeur d'origine via CL. La conversion en NO est réalisée au moyen de plusieurs solutions de réduction différentes, en fonction de la nature du NO métabolite. Après la conversion, NO libre du gaz est évacué du récipient de réaction par un gaz porteur (He, N2 ou Ar) dans la chambre de réaction de l' analyseur CL où l' ozone (O ₃₎ est combiné avec le NO pour former du dioxyde d'azote (NO ₂₎ dans son état activé. Avec le retour à l'état du sol, NO ₂ * émet dans la région infrarouge et photon émis est détecté par photomultiplicateur (PMT) du CL instrument. L'intensité de la lumière émise est directement proportionnelle à la concentration de NO dans la chambre de réaction, ce qui permet de calculer la concentration de l'espèce d'origine en utilisant les courbes d'étalonnage appropriées.

Dans notre protocole, nous avons d'abord présente détermination sur la base CL-de nitrite et de nitrate dans les milieux cliniques les plus utilisés - dans le sang et le plasma, puis nous discutons de la façon de déterminer ces ions dans des échantillons de tissus. Nous expliquons en détail comment conserver la concentration en nitrite dans des milieux d'origine physiologique de nitrite réactifs, tels que le sang et ses compartiments, le plasma et les globules rouges.

Protocole

Tous les protocoles, y compris l'utilisation des animaux ont été approuvés pour une utilisation par NIDDK Animal Care et l'utilisation Comité et le sang humain a été obtenu auprès du NIH banque de sang provenant de donneurs sains.

Préparation 1. Echantillon

1. Préparation d' une solution de nitrite de préserver
   1. Préparer une solution contenant 890 mM de ferricyanure de potassium (K ₃ Fe (CN) ₆₎ et 118 mM de NEM (N-éthylmaléimide) dans l' eau distillée. Dissoudre bien jusqu'à ce qu'il soit jaune clair sans cristaux présents. Ajouter NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) dans un mélange 1: 9 (v / v de NP-40 / solution). Mélanger doucement pour éviter de faire mousser et conserver à 4 ° C pendant environ une semaine).
2. Collecte et préparation d'échantillons de sang
   1. Collecter le sang en utilisant au moins une aiguille de 20 G pour éviter l'hémolyse avec de l'héparine pour éviter la coagulation (5 U / ml). Pour l'ensemble de l'échantillon de sang, mélanger le sang avec du nitrite solution de conservation immédiatement dans un rapport 1: 4 (v/ V solution / sang).
   2. Pour les échantillons de plasma et les globules rouges du sang, centrifuger le sang recueilli pendant 5 min à 4000 x g à 4 ° C pour séparer les globules rouges (RBC) et le plasma. Prenez le surnageant (plasma) et le mélanger avec du nitrite solution de conservation comme décrit ci-dessus pour la détermination des niveaux de nitrite dans le plasma.
   3. Retirez délicatement le plasma et la couche leucocytaire de l'échantillon et la pipette échantillon RBC à partir du bas du tube restant pour éviter la contamination par d'autres types de cellules sanguines en utilisant une pointe de pipette de coupure, et le transférer dans un tube contenant une solution préservant de nitrite dans le même le rapport ci-dessus.
   4. Mélanger chaque échantillon (plasma et RBC) avec du methanol froid à un rapport de 1: 1 ou 1: 2 (v / v échantillon / méthanol) et les centrifuger à 13 000 xg à 4 ° C pendant 15 minutes pour précipiter les protéines. Prenez le surnageant et l'utiliser pour la mesure du nitrite ou congeler les échantillons préparés, si nécessaire, sur la glace sèche et conserver à -80 ° C.
      Remarque: Nitrite rea rapidementavec oxyhémoglobine cts (oxyHb) dans le sang nitrate formant. Depuis oxyHb est toujours présent en grand excès sur le nitrite, cette réaction conduit à l'annihilation presque totale de nitrite de sang natif avec un laps de temps d'environ 10 min. Afin de préserver la majeure partie du nitrite endogène dans le sang, une solution de nitrite de conservation est ajouté à l'ensemble des échantillons de sang immédiatement après le prélèvement de sang. La solution sera rapidement lyser les globules rouges et oxyder oxyHb en méthémoglobine (metHb), une forme inactive de l'hémoglobine qui ne réagit pas chimiquement avec du nitrite.
3. Préparation des échantillons provenant d' autres types de fluide corporel
   1. Après la collecte de l'échantillon dans un récipient approprié, bien mélanger avec du nitrite en préservant solution, deproteinate et mesurer immédiatement ou congeler et conserver à -80 ° C.
4. Collecte et préparation d'échantillons de tissus
   1. Collecter les tissus des animaux perfusés avec une solution saline héparinée (10 U HEPArin / ml). environ 1 g de tissu d'accise souhaité et homogénéiser soit en utilisant un homogénéisateur manuel ou un homogénéisateur automatisé.
   2. Ajouter la quantité connue de nitrite préservant solution au besoin pour atteindre homogénat lisse.
   3. Une fois que le tissu est homogénéisé, précipiter les protéines en utilisant du methanol froid (1: 1 ou 1: 2 v / v de l'échantillon / méthanol) tel que décrit ci-dessus, les échantillons, puis centrifugation à 13 000 xg à 4 ° C pendant 15 min.
   4. Collecter les taux de nitrite surnageant et mesurer. Si nécessaire, congeler les échantillons à tout stade de la préparation sur glace sèche et conserver à -80 ° C.

2. Préparation de la réduction de Solutions

1. Tri-iodure (I ₃₎ solution réductrice pour le nitrite et R- (X) -NO espèces détermination ^1,3,4
   1. Préparer une solution de 301 mM KI mM I conjointement avec une solution 138 ₂ dans l' eau. Mélanger avec de l'acide acétique glacial à 2: 7, le rapport (v / v / solution d'acide) sur un agitateur magnétique pendant environ 30 min jusqu'à ce que toutesles cristaux soient dissous. De préférence rester en bouteille sombre, que l'iodure est sensible à la lumière, et d'utiliser moins d'une semaine de préparation.
      Remarque: Cette solution permettra de réduire le nitrite en NO et il sera également libérer NO de R-SNO, R-NNO et Fe-NO groupes fonctionnels (R- (X) -NO), mais le nitrate ne sera pas affecté. Le signal provenant des groupes fonctionnels à base de NO-dessus peut être séparé du signal vrai de nitrite par traitement de la moitié de l'échantillon avec acidifiée sulfanilamide (AS) et à comparer AS-traité et du signal non traité. Forme AS irréversiblement cation diazonium avec du nitrite et ce complexe ne peut être réduite par I ₃ solution. Pour que le traitement, préparer une solution 290 mM de sulfanilamide dans HCl 1 M et l'ajouter à une aliquote de l'échantillon dans un rapport 1: 9 (v / v AS / échantillon). Mesurer le signal CL dans les parties AS-traitées et non traitées de l'échantillon. Calculer le signal de nitrite vrai comme une différence de AS-traitées et non traitées partie de l'échantillon. Le nitrite peut également être mesurée en utilisant un nit sélectifrite de réduction solution de mélange d'acide ascorbique / acétique comme décrit dans la partie 2.2. Cependant, en raison de la faible quantité de habituellement R- (X) -NO espèces présentes, mesures à l'aide d'échantillons AS-non traités sont dans la plupart des cas une très bonne approximation de la teneur en nitrites totaux.
2. / Acide acétique (4A) , une solution d'acide ascorbique pour la détermination sélective de nitrite ²
   1. Préparer 500 mM d'acide ascorbique dans l'eau. Mélanger cette solution avec de l'acide acétique glacial dans un rapport 1: 7 (p / v, de l'acide ascorbique, l'acide acétique / v) pour préparer le mélange réactionnel.
      Remarque: Cette solution est spécifique pour le nitrite, ne sera pas communiqué NO de toute R- (X) -NO espèces ou de nitrate. Toutefois, la solution d'acide ascorbique et de l'acide acétique doit être préparée fraîchement chaque jour avant les mesures, comme l'acide ascorbique facilement oxydable en solution.
      L'achèvement de la réduction du nitrite dépend de la concentration d'acide ascorbique; et au moins 50 mM d'acide ascorbique est recommandé pour toutes les réduction de nitrite de plasma. Cependant, il est recommandé d'effectuer quelques expériences pilotes avec différentes concentrations d'acide ascorbique et les normes de nitrite dans la gamme attendue de concentration de nitrite avant les mesures de l'échantillon final. Gardez à l'esprit que l'acide ascorbique épuise légèrement au cours des mesures, des changements si fréquents du mélange réactionnel dans la chambre de réaction en verre sont recommandées.
3. Vanadium (III) solution réductrice de chlorure pour la détermination de nitrate ⁹
   1. Préparer la solution mM 51 de VCl ₃ dans HCl 1 M. solution de filtre à travers un filtre de 200 um et stocker dans une bouteille sombre, utiliser dans les deux semaines.
      Remarque: Cette solution permettra de réduire le nitrate, nitrite et tout R- (X) -NO espèces, donc si des quantités comparables de nitrite ou autre R- (X) -NO espèces sont présentes en même temps que le nitrate, la teneur en nitrates finale doit être calculée comme la différence entre les signaux CL obtenus avec VCl ₃ et I₃ solutions réductrices.

3. chimiluminescence (CL) Configuration et mesures Analyzer

1. Solution standard
   1. Préparer une solution à 1 uM de nitrite de sodium (NaNO _2). La même solution peut être utilisée pour les nitrites et les nitrates déterminations.
2. Utilisation analyseur de NO
   Note: Actuellement , il y a deux disponibles dans le commerce NO analyseurs qui sont assez sensibles à des fins de recherche biologique - Sievers NOA et ECOPHYSICS CLD 88Y. Ils fonctionnent tous deux sur le même principe; la principale différence est que 88Y CLD utilise l' oxygène de l'air ambiant pour rendre l' ozone (O _3), tandis que NOA nécessite un réservoir d'oxygène externe à cette fin. La procédure ci-dessous décrit la mise en place pour la Sievers NOA.
   1. configuration de l' instrument
      1. Effectuer la configuration initiale de l'analyseur de NO selon les recommandations du fabricantcomme on le voit sur la figure 1.
      2. ₂ O d' ouverture réservoir relié à l'instrument. Choisissez "analyse" et "entrer" dans le menu principal sur le panneau avant. Sur l'écran suivant, sélectionnez "Démarrer" et appuyez sur "enter". Branchez le piège d' acide (contenant 1 M NaOH) à l'instrument comme on le voit sur la figure 1.
      3. Attendre jusqu'à ce que le photomultiplicateur refroidit à température inférieure à -12 ° C et la chambre de réaction est évacuée à 6 Torr. Il faut environ 30 minutes pour atteindre une base plane et stable. La ligne de base doit se stabiliser dans 1 - 2 mV, sa valeur nominale est moins importante que sa stabilité.
         Remarque: Si le nitrate est mesuré, tourner sur le bain d'eau de refroidissement (fixé à 4 ° C, qui sert piège à froid pour les acides et vapeurs d' eau) et bain d'eau de chauffage (la chambre de réaction principale, 95 ° C). Le taux de la réduction du nitrate en NO dans VCl ₃ solution dépend de la température, et il est très lent à la salle tempehrature, augmentation si importante de la température est nécessaire pour observer la réaction.
      4. Ouvrez le réservoir Lui et relier la chambre de réaction en verre pour piéger l' acide comme on le voit sur la figure 1. Remplir la chambre de réaction avec une solution de réduction approprié, réduire la formation de bulles au minimum et raccorder la chambre de réaction au piège acide. Utilisation de tâtonnements, d'ajuster le taux bouillonnant Il pour correspondre au débit d'aspiration de l'appareil (généralement ~ 200 ml / min pour NOA de Siever).
      5. Allumez l'ordinateur contrôlant l'instrument et lancer le logiciel de liquide à base de Labview. Pour activer la communication entre l'instrument et le logiciel d'acquisition, appuyez sur "enter" quand dans le menu «données» jusqu'à ce que l'écran affiche "sortie activée", puis appuyez sur "clair" pour retourner à l'écran de données.
      6. Attendez une trace de référence stable sur l'écran et commencer à injecter des échantillons et des normes de nitrite dans la réduction de la solution à travers le septum. Toujours attendre d'atteindre une arrière base stableer le pic. Cela peut prendre jusqu'à 2 min. Le logiciel Liquid a une option pour «marquer» les temps d'injection et annoter l'injection et il va exporter ces commentaires dans un fichier séparé (filename.info) comme un complément utile dans le fichier de données (filename.data).
      7. Une fois les échantillons et les normes sont mesurées, choisissez "stop" dans le menu du logiciel Liquid - cela va écrire des données à partir d'un fichier temporaire dans un fichier permanent connu sous le nom "filename.data". Option Appuyer sur "abort" mettra fin à la mesure sans écrire les données acquises dans un fichier permanent.
      8. Pour mettre fin à l' expérience, débranchez l'appareil de la cuve de réaction en éteignant le robinet sur le dessus du récipient de réaction et débrancher le tuyau entre piège l' acide et la cuve de réaction (voir la figure 1). Maintenant, arrêtez NOA analyseur - appuyez sur "clear", allez dans "l'analyse", mettre la machine sur "veille" et "confirmer" veille. Si elle est utilisée régulièrement, leinstrument peut être laissé en mode veille pendant plusieurs semaines. Coupez l'alimentation en oxygène. Puis rincer la solution réductrice de la chambre de réaction, débrancher et fermer le réservoir Il de la cuve de réaction en verre et terminer le nettoyage récipient de réaction.
   2. Normes et injections d'échantillon
      1. Injecter 50 ul de solution de nitrite 1 pM dans le mélange de réaction en utilisant une seringue Hamilton bien lavée. Attendre au moins 1 - 2 min entre les injections pour obtenir une bonne séparation des pics. Répéter l'injection de 50 pi pour obtenir des doublons à chaque point de données. Laver la seringue avec de l'eau déminéralisée après chaque injection.
      2. Pour acquérir un ensemble complet de données pour la courbe standard, continuer avec des injections en double de 100, 150 pi (200 pi supplémentaires pourraient être nécessaires si des concentrations élevées de nitrite ou de nitrate sont attendus) d'une solution de nitrite de 1 uM. Dans chaque cas, prendre soin d'attendre jusqu'à ce que le signal retombe à la ligne de base, puis acquérir 1 - 2 min de base pour obtenir une bonne séparation des pics.
         Note: les normes de nitrites peuvent être mesurées à tout moment au cours des expériences. Cependant, il est préférable d'obtenir la courbe d'étalonnage avant la mesure des données, car elle sert également un contrôle indépendant de la fonctionnalité de l'instrument.
         Lorsque les données sont collectées, quantité d'échantillon injecté devrait conduire à des pics bien prononcés. Cependant, il faut garder à l'esprit que le photomultiplicateur est linéaire seulement jusqu'à ~ 800 mV, de sorte qu'aucun du pic devrait être supérieur à ~ 700 mV. Ceci peut être réalisé soit par une diminution de la quantité injectée échantillon ou diluer l'échantillon avec de l'eau déminéralisée. Chaque point doit être mesurée au moins en double.

Résultats

La figure 2 montre des résultats représentatifs recueillies à partir des normes et des cinq échantillons différents. Comme le montre cette figure, la tension photomultiplicateur augmente immédiatement après solution (normes ou échantillons) contenant du nitrite-est injecté dans la réduction de la solution (injections temps sont indiquées par des flèches rouges en dessous de la courbe) et revient à la valeur de base, une fois tous les nitrites présents dans ...

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Aliquotes de toutes les solutions (y compris l'eau) utilisées pour préparer, diluer ou autrement traiter les échantillons d'origine doivent être enregistrés et contrôlés pour le nitrite possible ou (plus souvent) contamination par les nitrates. Nous avons constaté que la plupart contamination provient de l'eau et de nombreux produits chimiques utilisés pour traiter l'échantillon (ferricyanure en particulier) contiennent aussi quantit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics