Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Resumo

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Resumo

O óxido nítrico (NO) é um dos principais reguladores de moléculas na homeostase vascular e também um neurotransmissor. NO enzimaticamente produzido é oxidado em nitrito e nitrato por interações com várias proteínas oxi-heme e outras vias ainda não são bem conhecidos. O processo inverso, a redução de nitrito e nitrato em NO tinha sido descoberto em mamíferos na última década e está ganhando a atenção como um dos possíveis caminhos para prevenir ou aliviar toda uma gama de doenças cardiovasculares, doenças metabólicas e musculares que são pensados ​​para estar associado a diminuição dos níveis de NO. É, portanto, importante para estimar a quantidade de NO e dos seus metabolitos em diferentes compartimentos do corpo - sangue, fluidos corporais e os vários tecidos. Sangue, devido à sua fácil acessibilidade, é o compartimento preferido utilizado para a estimativa de metabólitos. Devido à sua curta vida (alguns milissegundos) e baixa concentração de sub-nanomolar, medições confiáveis ​​diretos de sangue NO <em> in vivo apresentam grandes dificuldades técnicas. Assim NO disponibilidade geralmente é estimado com base na quantidade de seus produtos de oxidação, nitrito e nitrato. Estes dois metabolitos são sempre medidos separadamente. Existem vários métodos bem estabelecidos para determinar as suas concentrações em fluidos biológicos e tecidos. Aqui é apresentado um protocolo para o método de quimioluminescência (CL), com base na detecção espectrofotométrico de NO após nitrito ou nitrato de redução de tri-iodeto ou de vanádio (III) soluções de cloreto, respectivamente. A sensibilidade para nitrito e nitrato de detecção é em baixa gama nanomolar, que define CL como o método mais sensível disponível atualmente para determinar mudanças na NO vias metabólicas. Nós explicar em detalhe como preparar amostras de fluidos e tecidos biológicos, a fim de preservar valores originais de nitrito e nitrato presente no momento da coleta e como determinar os respectivos montantes em amostras. Limitações da técnica CL também são explained.

Introdução

Nitrito, e um nitrato menos estender, os níveis no sangue refletem o estado geral do corpo NO metabolismo. concentrações de nitrito no sangue e a maioria dos órgãos e tecidos são apenas em nanomolar alta ou baixa gama micromolar, nitrato está normalmente presente em quantidades muito mais elevadas - na gama micromolar. Alterações nos níveis de nitrito devido à progressão da doença ou mudanças nos hábitos alimentares são bastante pequeno e só pode ser medido utilizando um método muito sensível. Por causa de seus níveis muito diferentes e diversos processos metabólicos, determinação separada dos níveis de nitrito e nitrato é essencial. Os chamados "NO _x determinação", onde nitrito e nitrato são medidos em conjunto tem muito pouco valor.

Vários métodos para a quantificação de nitrito em várias amostras biológicas foram desenvolvidos - sendo o mais comum o mais antigo, com base na reacção de Griess, que tinha sido originalmente descrita em 1879. Mesmo com modificatio modernans, o limite de sensibilidade para nitrito atingível pelo método de Griess 'está em baixa gama micromolar. Quimiluminescência (CL), combinado com o tri-iodeto de solução redutora, é actualmente considerado como o método mais sensível, permitindo a quantificação na gama baixa nanomolar das concentrações de nitrito ^1-8,10,11. O mesmo método CL, combinado com vanádio (III), cloreto de solução redutora, pode ser usado para medições sensíveis de nitrato, com precisão na gama nanomolar ^9.

CL detecta NO gás livre. Portanto, nitrito, nitrato, R-nitrosotióis (R-SNO), R-nitrosaminas (R-Nno), ou compostos de metal-Não (posteriormente referido como manuscrito "R- (X) -NO"), tem de ser convertida em grátis Sem gás, a fim de quantificar seus valores originais via CL. Conversão de NO é efectuada através de várias soluções redutoras diferentes, dependendo da natureza do NO metabolito. Após a conversão, livre Nenhum gás é purgado do recipiente de reacção por um gás transportador (He, N2 ou Ar) para dentro da câmara de reacção de um analisador CL onde o ozono _(O3) é combinado com NO para formar dióxido de azoto _(NO2) no seu estado activado. Com o retorno ao estado fundamental, NO ₂ * emite na região do infravermelho e fóton emitido é detectada pelo fotomultiplicador (PMT) de instrumento de CL. A intensidade de luz emitida é directamente proporcional à concentração de NO na câmara de reacção, o que permite o cálculo da concentração das espécies originais usando curvas de calibração adequada.

Em nosso protocolo, primeiro presente deliberação baseada em CL de nitrito e nitrato nos ambientes clínicos mais utilizados - em sangue e plasma, e depois discutimos como determinar estes íons em amostras de tecido. Nós também explicar em detalhes como preservar a concentração de nitrito fisiológica original, em ambientes de nitrito-reativa, como o sangue e seus componentes, plasma e glóbulos vermelhos.

Protocolo

Todos os protocolos, incluindo o uso de animais foram aprovados para uso pelo NIDDK Animal Care e do Comitê Use e sangue humano foi obtido a partir dos bancos de sangue NIH de doadores saudáveis.

Preparação 1. Amostra

1. Preparação da solução de nitrito de preservação
   1. Prepara-se uma solução contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K ₃ Fe (CN) ₆₎ e NEM 118 mM (N-etilmaleimida) em água destilada. Dissolva bem até que fique claro amarelo sem cristais presentes. Adicionar NP-40 (octil phenoxylpolyethoxylethanol) em uma proporção de 1: 9 (v / v, NP-40 / solução). Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e armazenar a 4 ° C, durante cerca de uma semana).
2. Recolha e preparação de amostras de sangue
   1. Recolha de sangue, utilizando, pelo menos, uma agulha de 20 G para evitar hemólise com a heparina para evitar a coagulação (5 U / ml). Para a amostra de sangue, misturar sangue com nitrito de solução conservante imediatamente em uma proporção de 1: 4 (v/ V / solução de sangue).
   2. Para as amostras de plasma e células vermelhas do sangue, centrifugação do sangue recolhido durante 5 min a 4000 xg, a 4 ° C para separar as células vermelhas do sangue (RBC) e plasma. Tome-se o sobrenadante (plasma) e misturá-lo com nitrito de solução conservante, como descrito acima para a determinação dos níveis de nitrito no plasma.
   3. Cuidadosamente remover a restante plasma e buffy coat a partir da amostra e da pipeta da amostra de glóbulos vermelhos a partir do fundo do tubo para evitar a contaminação por outros tipos de células do sangue, utilizando uma ponta de pipeta de corte, e transferi-lo para um tubo contendo solução conservante nitrito na mesma razão como acima.
   4. Misturar cada amostra (plasma e glóbulos vermelhos) com metanol frio a uma razão de 1: 1 ou 1: 2 (v / v da amostra / metanol) e centrifugar para a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min para precipitar as proteínas. Leve o sobrenadante e usá-lo para a medição de nitrito ou congelar amostras preparadas, se necessário, em gelo seco e armazenar a -80 ° C.
      Nota: Nitrito rea rapidamentects com oxi-hemoglobina (oxiHb) em nitrato de formação de sangue. Desde oxiHb está sempre presente em grande excesso em relação nitrito, esta reacção conduz à aniquilação quase completa de nitrito de sangue nativo com um prazo de ~ 10 min. A fim de preservar a maioria de nitrito de sangue endógena, solução de preservação é adicionado nitrito de toda a amostra de sangue imediatamente após a colheita de sangue. A solução irá rapidamente lisar as células vermelhas do sangue e oxidar oxiHb em metemoglobina (metHb), uma forma inactiva de hemoglobina que não reage quimicamente com o nitrito.
3. Preparação de amostras de outros tipos de fluido corporal
   1. Após a coleta de amostra para um recipiente adequado, misture bem com nitrito de preservar solução, deproteinate e medir imediatamente ou congelar e armazenar a -80 ° C.
4. Recolha e preparação de amostras de tecido
   1. Recolha de tecidos animais perfundidos com solução salina heparinizada (10 U HEPARin / ml). Especial de consumo de cerca de 1 g de tecido desejado e homogeneizar ou usando um homogeneizador manual ou automatizado um homogeneizador.
   2. Adicionar quantidade conhecida de solução de nitrito de preservação, conforme necessário para atingir homogenato suave.
   3. Uma vez que o tecido é homogeneizado, precipitar as proteínas utilizando metanol frio (1: 1 ou 1: 2, razão v / v de amostra / metanol), como descrito acima, as amostras depois de centrifugação a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min.
   4. Recolha níveis de nitrito sobrenadante e medida. Se necessário, congelar amostras em qualquer fase da preparação sobre gelo seco e armazenar a -80 ° C.

2. Preparação de reduzir Soluções

1. Tri-iodeto (I ₃₎ reduzir a solução de nitrito e R- (X) -NO espécies determinação ^1,3,4
   1. Prepara-se uma solução de Kl 301 mM em conjunto com 138 mM de solução de _I2 em água. Misturar-se com ácido acético glacial na proporção de 2: 7 (v / v / solução de ácido) num agitador magnético durante ~ 30 min, até que todoscristais são dissolvidos. Preferencialmente manter em garrafa escura, como iodeto é sensível à luz, e usar dentro de uma semana de preparação.
      Nota: Esta solução reduzirá o nitrito em NO e que também irá liberar NO a partir de R-SNO, R-NNO e Fe-NO grupos funcionais (R- (X) -NO), mas o nitrato não será afetado. O sinal a partir dos grupos funcionais à base de NO acima podem ser separados a partir do sinal verdadeiro nitrito por tratamento de metade da amostra com sulfanilamida acidificada (AS) e comparando-tratado como sinal e não tratada. AS irreversivelmente forma de diazónio catião com nitrito e este complexo não pode ser reduzida em I ₃ solução. Porque, assim como o tratamento, prepare uma solução 290 mM de sulfanilamida em HCl 1 M e adicioná-lo a uma alíquota de amostra na proporção de 1: 9 (v / v AS / amostra). Medir o sinal de CL em partes AS-tratadas e não tratadas da amostra. Calcule o sinal de nitrito de verdade, como uma diferença de parte AS-tratados e não tratados da amostra. Nitrito pode também ser medido usando um nit selectivarito de redução de solução de / mistura de ácido acético ascórbico como descrito na parte 2.2. No entanto, devido à pequena quantidade geralmente de R- (X) -NO espécies presentes, medições usando como amostras-não tratados são na maioria dos casos, uma muito boa aproximação do teor total de nitrito.
2. O ácido ascórbico / ácido acético solução (4A) para a determinação selectiva de nitrito de ^dois
   1. Prepare o ácido ascórbico 500 mm de água. Misturar esta solução com ácido acético glacial numa razão de 1: 7 (v / v, ácido ascórbico / ácido acético) para se preparar a mistura de reacção.
      Nota: Esta solução é específico para nitrito, não vai liberar NO a partir de qualquer R- (X) -NO espécie ou nitrato. No entanto, a solução de ácido acético e ascórbico deve ser preparada de fresco a cada dia antes das medições, como o ácido ascórbico oxida facilmente em solução.
      Conclusão de redução de nitritos depende da concentração de ácido ascórbico; e ácido ascórbico 50 mM, pelo menos, é recomendado para R completaedução de nitrito de plasma. No entanto, recomenda-se realizar algumas experiências piloto com diferentes concentrações de ácido ascórbico e padrões de nitrito no intervalo de concentração de nitrito esperado antes das medições por amostra final. Tenha em atenção que o ácido ascórbico esgota ligeiramente durante as medições, mudanças frequentes de modo de mistura de reacção na câmara de reacção de vidro são recomendados.
3. Vanádio (III) solução de cloreto de redução para a determinação de nitrato de ⁹
   1. Preparar uma solução 51 mM de VCl ₃ em HCl 1M. Filtrar a solução através de um filtro de 200 um e armazenar em um frasco escuro, use dentro de duas semanas.
      Nota: Esta solução irá reduzir o nitrato, nitrito e todos R- (X) -NO espécies, por isso, se quantidades comparáveis de nitrito ou outro R- (X) -NO espécies estão presentes em conjunto com o nitrato, o teor final de nitrato tem de ser calculado como a diferença entre os sinais obtidos com CL VCl ₃ e I₃ reduzindo soluções.

3. A quimiluminescência (CL) de configuração e Medidas Analyzer

1. Solução padrão
   1. Prepare 1 uM solução de nitrito de sódio (NaNO _2). A mesma solução pode ser utilizado para determinações de nitrito e nitrato.
2. Usando analisador
   Nota: Atualmente, existem dois disponíveis comercialmente NÃO analisadores que são sensíveis o suficiente para fins de pesquisa biológica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Ambos operam no mesmo princípio; a diferença principal é que CLD 88Y utiliza oxigénio do ar ambiente para fazer o ozono _(O3), enquanto NOA requer um tanque de oxigénio exterior para o efeito. O procedimento abaixo descreve o conjunto para o Sievers NOA.
   1. configuração do instrumento
      1. Faça um ajuste inicial do analisador de acordo com as recomendações do fabricantecomo visto na Figura 1.
      2. Abrir O tanque ₂ ligado ao instrumento. Escolha "análise" e "enter" no menu principal no painel frontal. Na tela seguinte, escolha "iniciar" e pressione "Enter". Ligar a armadilha de ácido (contendo NaOH 1 M) para o instrumento, conforme visto na Figura 1.
      3. Esperar até fotomultiplicador arrefece para a temperatura inferior a -12 ° C e a câmara de reacção é evacuado a 6 Torr. Demora cerca de 30 min para chegar a uma linha de base plana e estável. A linha de base precisa para estabilizar dentro de 1 - 2 mV, o seu valor nominal é menos importante do que a sua estabilidade.
         Nota: Se o nitrato é medido, ligar o banho de arrefecimento de água (definido a 4 ° C, o que serve como armadilha fria por vapores de ácido e água) e o banho de água com aquecimento (a câmara de reacção principal, 95 ° C). A taxa de redução de nitrato em NO VCl ₃ em solução é dependente da temperatura, e é muito lenta em Tempe quartotura, de modo substancial aumento da temperatura é necessária para observar a reacção.
      4. Abra o tanque Ele e ligar a câmara de reacção de vidro para armadilha de ácido, como visto na Figura 1. Encha a câmara de reacção com uma solução de redução apropriado, reduzir a borbulhar para o mínimo e ligar câmara de reação para a armadilha de ácido. Usando tentativa e erro, ajustar a taxa de borbulhamento Ele para coincidir com a taxa de aspiração do instrumento (normalmente a ~ 200 mL / min para NOA de Siever).
      5. Ligue o computador que controla o instrumento e iniciar o software líquido baseado em LabVIEW. Para ativar a comunicação entre o instrumento e o software de aquisição, pressione "Enter" quando em "menu de dados" até que a tela lê "saída habilitado", em seguida, pressione "claro" para voltar para a tela de dados.
      6. Espere por um traço linha de base estável na tela e começar a injetar amostras e padrões de nitrito na solução redutora através do septo. Sempre esperar para chegar a um ré linha de base estáveler o pico. Isso pode levar até 2 min. O software líquido tem uma opção para "marcar" tempos de injecção e anotar a injeção e vai exportar estes comentários em um arquivo separado (filename.info) como um complemento útil para o arquivo de dados (filename.data).
      7. Uma vez que as amostras e padrões são medidos, escolha "stop" opção no menu de software líquido - o que irá gravar dados de um arquivo temporário em um arquivo permanente conhecido como "filename.data". Pressionando opção "abortar" irá terminar a medição sem escrever dados adquiridos em um arquivo permanente.
      8. Para terminar experimento, desligue o aparelho do recipiente de reacção, desligando a torneira na parte superior do recipiente de reacção e desligue o tubo entre a armadilha ácida e vaso de reação (ver Figura 1). Agora, pare de analisador NOA - pressione "claro", vá para "análise", colocar máquina em "standby" e espera "confirmar". Se usado regularmente, oinstrumento pode ser deixado em modo de espera durante várias semanas. Desligue o fornecimento de oxigênio. Em seguida, lavar a solução redutora da câmara de reacção, de desconexão e fechar o tanque Ele a partir do vaso de reacção de vidro e proceder ao acabamento vaso de reacção.
   2. Padrões e amostras injecções
      1. Injecte 50 ul de solução de nitrito de 1 uM na mistura reaccional utilizando uma seringa de Hamilton bem lavadas. Aguarde pelo menos 1 - 2 min entre as injeções para conseguir uma boa separação dos picos. Repita injecção de 50 ul para chegar duplicados para cada ponto de dados. Lavar seringa com água desionizada após cada injecção.
      2. Para adquirir conjunto completo de dados para curva padrão, continue com injecções em duplicado de 100, 150 mL (adicional de 200 mL pode ser necessária se altas concentrações de nitrito ou nitrato são esperados) de solução de nitrito de 1 �. Em cada caso, ter o cuidado de esperar até que o sinal cai de volta para a linha de base e, em seguida, adquirir 1 - 2 min da linha de base para alcançar uma boa separação dos picos.
         Nota: os padrões de nitrito pode ser medido em qualquer momento durante as experiências. No entanto, é preferível para obter a curva padrão, antes da medição de dados, como também serve como um controlo independente de funcionalidade instrumento.
         Quando os dados são coletados, quantidade de amostra injetada deve levar a picos bem pronunciadas. No entanto, deve ser mantido em mente que o fotomultiplicador é linear apenas até ~ 800 mV, de modo nenhum o pico deve ser superior a ~ 700 mV. Isto pode ser conseguido quer através da diminuição da quantidade injectada amostra ou a diluição da amostra com a água desionizada. Cada ponto deve ser medida pelo menos em duplicado.

Resultados

A Figura 2 mostra resultados representativos recolhidos a partir de padrões e cinco amostras diferentes. Como mostrado nesta figura, os aumentos de tensão fotomultiplicador imediatamente após nitrito contendo a solução (padrões ou amostras) é injectado na solução redutora (injecções de tempos estão indicados por setas vermelhas abaixo da curva) e regressa ao valor basal, uma vez todos os nitritos presentes no injectado solução foi reduzida. É também evide...

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

Alíquotas de todas as soluções (incluindo a água) utilizados para preparar, diluir ou de outro modo tratar amostras originais têm de ser salvo e devolvido para possível nitrito ou (mais frequentemente) contaminação por nitrato. Nós descobrimos que a maioria vem de contaminação de água e muitos produtos químicos utilizados para tratar a amostra (ferricianeto em particular) também contém quantidades significativas de contaminação de nitrato em...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics