Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Zusammenfassung

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Zusammenfassung

Stickstoffmonoxid (NO) ist einer der wichtigsten Reglermolekülen in der vaskulären Homöostase und auch ein Neurotransmitter. Enzymatisch erzeugte NO wird durch Wechselwirkungen mit verschiedenen Oxy-Häm-Proteine ​​und andere noch nicht bekannte Wege in Nitrit und Nitrat oxidiert. Der umgekehrte Vorgang, Reduzierung von Nitrit und Nitrat in NO hatte bei Säugetieren in den letzten zehn Jahren entdeckt worden, und es gewinnt Aufmerksamkeit als einer der möglichen Wege entweder zu verhindern oder eine ganze Reihe von Herz-Kreislauf-, Stoffwechsel- und Muskelerkrankungen lindern, die gedacht sind mit verminderter NO-Spiegel in Verbindung gebracht werden. Es ist daher wichtig, die Menge von NO und seinen Metaboliten in verschiedenen Kompartimenten abzuschätzen - Blut, Körperflüssigkeiten und den verschiedenen Geweben. Blut, aufgrund seiner leichten Zugänglichkeit ist die bevorzugte Fach für die Abschätzung der NO-Metaboliten verwendet. Aufgrund seiner kurzen Lebensdauer (einige Millisekunden) und niedrige subnanomolarer Konzentration, direkte zuverlässige Messungen des Blut NO <em> in vivo vor große technische Schwierigkeiten. Somit wird keine Verfügbarkeit in der Regel bezogen auf die Menge der Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat geschätzt. Diese beiden Metaboliten werden immer separat gemessen. Es gibt mehrere gut etablierte Methoden ihre Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten und Geweben zu bestimmen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Chemilumineszenz-Methode (CL) bezogen auf spektrophotometrische Detektion von NO nach Nitrit oder Nitrat-Reduktion durch Triiodid-oder Vanadium (III) chlorid-Lösungen, respectively. Die Empfindlichkeit für Nitrit und Nitrat-Erkennung ist in niedrigen nanomolaren Bereich, der CL als die empfindlichste Methode setzt derzeit zur Verfügung stehenden Änderungen der NO Stoffwechselwege zu bestimmen. Wir erklären im Detail, wie Proben aus biologischen Flüssigkeiten und Geweben herzustellen, um zu bewahren ursprünglichen Mengen an Nitrit und Nitrat anwesend zum Zeitpunkt der Sammlung und wie ihre jeweiligen Mengen in Proben zu bestimmen. Einschränkungen der CL-Technik sind auch explained.

Einleitung

Nitrite und zu einem weniger verlängern Nitrat-Spiegel im Blut reflektieren Gesamtzustand der Körper nicht den Stoffwechsel. Nitrit-Konzentrationen in Blut und die meisten Organe und Gewebe sind nur in hohen nanomolaren oder niedrigen mikromolaren Bereich, Nitrat in wesentlich höheren Mengen in der Regel vorhanden ist - in mikromolaren Bereich. Änderungen in der Nitritwerte wegen Krankheitsprogression oder Veränderungen der Ernährungsgewohnheiten sind recht klein und kann nur über eine sehr empfindliche Methode gemessen werden. Aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen Ebenen und mit unterschiedlichen Stoffwechselprozesse, separate Bestimmung von Nitrit und Nitratgehalt ist von wesentlicher Bedeutung. So genannte "NO _x Bestimmung" von Nitrit und Nitrat gemessen werden zusammen hat sehr wenig Wert.

Mehrere Verfahren zur Nitrit in verschiedenen biologischen Proben zu quantifizieren entwickelt wurden - die häufigste die älteste, basiert auf der Griess-Reaktion, die mit modernen modificatio in 1879. Selbst ursprünglich beschrieben worden warns, ist die Empfindlichkeitsgrenze für Nitrit erreichbar durch Griess 'Methode in niedrigen mikromolaren Bereich. Chemilumineszenz (CL), kombiniert mit Tri-Jodid - Lösung zu reduzieren, ist derzeit die empfindlichste Methode betrachtet, so dass eine Quantifizierung im niedrigen nanomolaren Bereich von Nitritkonzentrationen ^1-8,10,11. Das gleiche Verfahren CL, kombiniert mit Vanadin (III) -chlorid - Lösung zu reduzieren, kann für empfindliche Messungen von Nitrat verwendet werden, mit Präzision im nanomolaren Bereich ^9.

CL erkennt freies Gas NO. Daher, Nitrit, Nitrat, R-Nitrosothiole (R-SNO), R-Nitrosoamine (R-NNO) oder Metall-NO-Verbindungen (später in Manuskript bezeichnet als "R- (X) -NO") muss in umgewandelt werden frei von NO-Gas, um ihre ursprünglichen Beträge über CL zu quantifizieren. Umwandlung zu NO ist, mehrere verschiedene Reduktionslösungen erreichen mit, je nach Art des NO-Metaboliten. Nach der Umwandlung wird frei NO-Gas aus dem Reaktionsgefäß durch ein Trägergas (He, N gespült2 oder Ar) in die Reaktionskammer von CL - Analysator , wo Ozon (O ₃₎ mit NO kombiniert wird Stickstoffdioxid (NO ₂₎ in seinem aktivierten Zustand zu bilden. Mit Rückkehr zum Grundzustand, NO ₂ * emittiert im Infrarotbereich und emittierten Photons durch Photomultiplier (PMT) von CL Instrument detektiert. Die Intensität des emittierten Lichts ist direkt proportional zur NO-Konzentration in der Reaktionskammer, die Berechnung der Konzentration der ursprünglichen Spezies unter Verwendung geeigneter Kalibrierungskurven ermöglicht.

In unserem Protokoll haben wir zunächst vorliegende CL-basierte Bestimmung von Nitrit und Nitrat in den am häufigsten verwendeten klinischen Einstellungen - im Blut und Plasma, und dann besprechen wir, wie diese Ionen in Gewebeproben zu bestimmen. Wir erklären auch im Detail, wie die ursprüngliche physiologischen Nitritkonzentration in Nitrit-reaktive Umgebungen zu erhalten, wie zum Beispiel Blut und seine Fächer, Plasma und roten Blutkörperchen.

Protokoll

Alle Protokolle Verwendung von Tieren, einschließlich wurden für die Verwendung von NIDDK Animal Care und Use Committee genehmigt und menschlichem Blut wurde aus NIH Blutbank von gesunden Spendern erhalten.

1. Probenvorbereitung

1. Herstellung von Nitrit Konservierungslösung
   1. Bereiten einer Lösung , die 890 mM Kaliumferricyanid (K ₃ Fe (CN) ₆₎ und 118 mM NEM (N-Ethylmaleimid) in destilliertem Wasser. Man löst gut, bis es keine Kristalle vorhanden gelb klar. In NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) in einer 1: 9-Verhältnis (v / v, NP-40 / Lösung). Vorsichtig mischen zu vermeiden, Schäumen und lagern bei 4 ° C für etwa eine Woche).
2. Sammlung und Aufbereitung von Blutproben
   1. Sammeln Blut unter Verwendung mindestens eine 20 G Nadel Hämolyse mit Heparin zu vermeiden Koagulation (5 U / ml) zu verhindern. Für die Vollblutprobe, mischen Blut mit Nitritlösung sofort in einem 1 zu erhalten: 4-Verhältnis (v/ V Lösung / Blut).
   2. Für Plasma und roten Blutkörperchen Proben, zentrifugieren Sie das gesammelte Blut für 5 min bei 4000 xg bei 4ºC roten Blutzellen (RBC) und Plasma zu trennen. Nehmen Sie den Überstand (Plasma) und mischen Sie es mit Nitrit Konservierungslösung wie für die Bestimmung von Nitritspiegel im Plasma oben beschrieben.
   3. Entfernen Sie vorsichtig mit einem cut-off Pipettenspitze verbleibende Plasma und Buffy-Coat aus der Probe und Pipetten RBC Probe aus dem Boden des Röhrchens Kontamination durch andere Arten von Blutzellen zu vermeiden, und gibt sie in eine Röhre enthält, Nitrit Konservierungslösung in der gleichen Verhältnis wie oben.
   4. Mischen jede Probe (Plasma und RBC) mit kaltem Methanol in einem Verhältnis 1: 1 oder 1: 2 (v / v sample / Methanol) und zentrifugiert sie bei 13000 × g bei 4 ° C für 15 min, um Proteine ​​auszufällen. Nehmen Sie den Überstand und nutzen es für Nitrit-Messung oder einfrieren vorbereiteten Proben, falls erforderlich, auf Trockeneis und bei -80 ° C.
      Hinweis: Nitrite schnell reacts mit Oxyhämoglobin (Oxy-Hb) im Blut bilden Nitrat. Da Oxy-Hb immer in großen Überschuss über Nitrit ist, führt diese Reaktion zu einer fast vollständigen Vernichtung der einheimischen Blut Nitrit mit einem Zeitrahmen von ~ 10 min. Um sich zu schützen die meisten endogenen Blut Nitrit, Nitrit-Konservierungslösung auf die Vollblut-Proben unmittelbar nach der Blutentnahme zugesetzt. Die Lösung wird schnell rote Blutkörperchen lysieren und Oxy-Hb in Methämoglobin (MetHb), eine inaktive Form von Hämoglobin oxidieren die chemisch nicht mit Nitrit reagiert.
3. Vorbereitung von Proben aus anderen Arten von Körperflüssigkeit ,
   1. Nach der Probensammlung in geeignete Behälter, gut mischen mit Nitrit Konservierungslösung, deproteinate und sofort messen oder einfrieren und bei -80 ° C.
4. Sammlung und Vorbereitung von Gewebeproben
   1. Sammeln Sie Gewebe von Tieren durchbluteten mit heparinisierter Kochsalzlösung (10 U Heparin / ml). Verbrauch etwa 1 g des gewünschten Gewebe und homogenisieren entweder eine manuelle oder eine automatisierte Homogenisator Homogenisator.
   2. In bekannten Menge an Nitrit Konservierungslösung nach Bedarf glatt Homogenat zu erreichen.
   3. Sobald Gewebe homogenisiert ist, auszufällen Proteine ​​unter Verwendung von kaltem Methanol (1: 1 oder 1: 2-Verhältnis v / v sample / Methanol) wie oben beschrieben, dann Zentrifuge Proben bei 13000 × g bei 4 ° C für 15 min.
   4. Sammeln Sie den Überstand und Maß Nitritgehalt. Bei Bedarf einfrieren Proben in jeder Phase der Vorbereitung auf Trockeneis und bei -80 ° C.

2. Vorbereitung Lösungen Reduzierung

1. Tri-Iodid (I ₃₎ Reduktionslösung für Nitrit und R- (X) -NO Spezies Bestimmung ^1,3,4
   1. Eine Lösung aus 301 mM KI zusammen mit 138 mM I ₂ - Lösung in Wasser. Mischen mit Eisessig in 2: 7-Verhältnis (v / v Lösung / Säure) auf einem Magnetrührer für ~ 30 min, bis das gesamteKristalle werden aufgelöst. halten vorzugsweise in dunklen Flasche, als Jodid empfindliche Licht ist, und innerhalb einer Woche Vorbereitung.
      Hinweis: Diese Lösung reduziert Nitrit in NO und es wird auch Release NO von R-SNO, R-NNO und Fe-NO funktionellen Gruppen (R- (X) -NO), aber Nitrat wird nicht beeinträchtigt. Das Signal von den oben NO-basierten funktionellen Gruppen können von der wahren Nitrit Signal durch Behandlung Hälfte der Probe mit angesäuertem Sulfanilamid (AS) und Vergleichens AS-behandelten und unbehandelten Signal getrennt werden. AS irreversibel bildet Diazoniumkations mit Nitrit und dieser Komplex nicht durch I ₃ Lösung reduziert werden. Für AS Behandlung vorbereiten 290 mM Lösung von Sulfanilamid in 1 M HCl und fügen es zu einer aliquoten Probe im Verhältnis 1: 9 (v / v AS / Probe). Messung der CL-Signal in AS-behandelten und unbehandelten Teilen der Probe. Berechnen Sie die wahre Nitrit Signal als Differenz von AS-behandelten und unbehandelten Teil der Probe. Nitrite können auch durch die Verwendung eines selektiven nit gemessen werdenrite-reduzierende Lösung von Ascorbinsäure / Mischung Essigsäure, wie in Teil 2.2 beschrieben. Aufgrund der meist geringen Menge an R- (X) -NO Spezies vorhanden, Messungen mit AS-unbehandelten Proben sind in den meisten Fällen eine sehr gute Annäherung der gesamten Nitritgehalt.
2. Ascorbinsäure / Essigsäure (4A) Lösung zur selektiven Bestimmung von Nitrit ²
   1. Bereiten 500 mM Ascorbinsäure in Wasser. Mischen, diese Lösung mit Eisessig in einem Verhältnis 1: 7 (v / v, Ascorbinsäure / Essigsäure), um die Reaktionsmischung herzustellen.
      Anmerkung: Diese Lösung ist spezifisch für Nitrit, wird loslassen nicht NO aus jedem R- (X) -NO Spezies oder Nitrat. Jedoch muß die Lösung von Ascorbinsäure und Essigsäure frisch vor den Messungen jeden Tag hergestellt werden, wie Ascorbinsäure leicht in Lösung oxydiert.
      Abschluss der Nitritreduktion hängt von Ascorbinsäure-Konzentration; und mindestens 50 mM Ascorbinsäure zur vollständigen r empfohleneduction von Plasma-Nitrit. Es wird jedoch empfohlen, einige Pilotexperimente mit verschiedenen Konzentrationen von Ascorbinsäure und Nitrit-Standards in der erwarteten Nitrit Konzentrationsbereich vor der endgültigen Probe Messungen durchzuführen. Beachten Sie, dass etwas Ascorbinsäure während der Messungen dezimiert, so häufigen Wechsel der Reaktionsmischung in der Glasreaktionskammer empfohlen.
3. Vanadium (III) chlorid - Reduktionslösung zur Nitratbestimmung ⁹
   1. Vorbereitung 51 mM Lösung von VCl ₃ in 1 M HCl. Filter-Lösung durch 200 & mgr; m-Filter und Speicher in einer dunklen Flasche, verwenden Sie innerhalb von zwei Wochen.
      Hinweis: Diese Lösung reduziert Nitrat, Nitrit und alle R- (X) -NO Arten, so dass , wenn vergleichbare Mengen an Nitrit oder anderen R- (X) -NO Spezies vorhanden sind , zusammen mit Nitrat, hat die endgültige Nitratgehalt berechnet werden als die Differenz zwischen den Signalen CL mit VCl ₃ und I erhalten₃ Reduzierung Lösungen.

3. Chemilumineszenz (CL) Analyzer-Setup und Messungen

1. Standardlösung
   1. Vorbereitung 1 uM Lösung von Natriumnitrit (NaNO _2). Die gleiche Lösung kann für Nitrit und Nitrat-Bestimmungen verwendet werden.
2. Mit NO - Analysator
   Hinweis: Derzeit gibt es zwei im Handel erhältlichen NO - Analysatoren , die für die Zwecke der biologischen Forschung empfindlich genug sind - Sievers NOA und Ecophysics CLD 88Y. Beide arbeiten nach dem gleichen Prinzip; Ozon (O ₃₎ zu machen, während NOA benötigt eine externe Sauerstofftank für diesen Zweck der Hauptunterschied besteht darin , dass CLD 88Y Sauerstoff aus der Raumluft verwendet. Das folgende Verfahren beschreibt die Menge für die Sievers NOA auf.
   1. Die Geräteeinstellung
      1. Führen Sie die erstmalige Konfiguration des NO-Analysator gemäß den Empfehlungen des Herstellerswie in Abbildung 1 zu sehen.
      2. Öffnen O ₂ Tank mit dem Gerät verbunden. Wählen Sie "Analyse" und "Enter" aus dem Hauptmenü auf der Frontplatte. Auf dem nächsten Bildschirm wählen Sie "Start" und drücken Sie "Enter". Verbinden der Säurefalle (mit 1 M NaOH) an das Gerät wie in Figur 1 gesehen.
      3. Warten, bis Photomultiplier auf Temperatur unter -12 ° C abgekühlt und die Reaktionskammer wird auf 6 Torr evakuiert. Es dauert etwa 30 Minuten eine stabile flache Basislinie zu erreichen. Die Baseline muss innerhalb von 1 zu stabilisieren - 2 mV, dessen Nennwert ist weniger wichtig als seine Stabilität.
         Hinweis: Wenn Nitrat gemessen wird, schalten Sie das Kühlwasserbad (eingestellt bei 4 ° C, die für die Säure und Wasserdampf als Kühlfalle dient) und Heizung Wasserbad (Hauptreaktionskammer, 95 ° C). Die Geschwindigkeit der Reduktion von Nitrat zu NO in VCl ₃ Lösung ist temperaturabhängig, und es ist sehr langsam bei Raum tempetur, so wesentliche Erhöhung der Temperatur benötigt wird, um die Reaktion zu beobachten.
      4. Öffnen Sie den Tank Er und schließen Sie das Glasreaktionskammer Säurefalle , wie in Abbildung 1 zu sehen. Füllen Sie die Reaktionskammer mit geeigneten Reduktionslösung, reduzieren Sie die sprudelnden auf ein Minimum und schließen Reaktionskammer zu der Säurefalle. Mit Versuch und Irrtum, stellen Sie die Er sprudelt Rate des Instruments Saugvolumenstrom anzupassen (in der Regel ~ 200 ml / min für Siever der NOA).
      5. Schalten Sie den Computer das Gerät zu steuern und starten Labview-basierte flüssige Software. So schalten Sie die Kommunikation zwischen dem Instrument und der Erfassungssoftware, drücken Sie "Enter", wenn sie in "Daten-Menü", bis das Bild liest "Ausgang freigegeben", dann "clear" drücken, um Daten-Bildschirm zurückzukehren.
      6. Warten Sie auf eine stabile Basislinie Spur auf dem Bildschirm und starten Proben und Nitrit Standards Injektion in Lösung durch das Septum zu verringern. Warten Sie immer eine stabile Basislinie achtern zu erreichener den Gipfel. Dies kann bis zu 2 Minuten dauern. Das Liquid-Software verfügt über eine Option "Markierung" Zeiten der Einspritzung und die Injektion mit Anmerkungen versehen und es wird diese Kommentare in eine separate Datei (filename.info) als sinnvolle Ergänzung zu der Datendatei (filename.data) exportieren.
      7. Sobald Proben und Standards gemessen werden, wählen Sie "Stopp" Option in dem Liquid Software-Menü - diese werden die Daten aus einer temporären Datei in eine permanente Datei schreiben als "filename.data" bekannt. Durch Drücken von "Abbruch" Option Messung beenden, ohne erfassten Daten in eine permanente Datei zu schreiben.
      8. Zum Beenden Experiment, trennen Sie das Gerät aus dem Reaktionsgefäß durch den Hahn auf der Spitze des Reaktionsgefäßes auszuschalten und trennen Sie den Schlauch zwischen Säurefalle und Reaktionsgefäß (siehe Abbildung 1). Jetzt NOA Analysator stoppen - drücken Sie "klar", gehen Sie auf "Analyse", legte Maschine auf "Standby" und "Bestätigen" Standby-Modus. Bei regelmäßiger Anwendung derInstrument kann für mehrere Wochen im Standby-Modus bleiben. Schalten Sie Zufuhr von Sauerstoff. Dann spülen Sie die Reduktionslösung aus der Reaktionskammer, trennen und schließen Sie den Er Tank aus dem Reaktionsgefäß aus Glas und Reaktionsbehälter fertig zu reinigen.
   2. Standards und Probeninjektionen
      1. Einzuspritzen 50 ul von 1 uM Nitritlösung in das Reaktionsgemisch eine gut gewaschene Hamilton Spritze. Warten für mindestens 1 bis 2 min zwischen den Injektionen gute Trennung von Peaks zu erzielen. Wiederholen Sie die Injektion von 50 & mgr; l auf Duplikate zu jedem Datenpunkt erhalten. Waschen Sie Spritze mit VE-Wasser nach jeder Injektion.
      2. Um eine volle Satz von Daten für Standardkurve erwerben, weiterhin mit doppelten Injektionen von 100, 150 & mgr; l (weitere 200 & mgr; l ist erforderlich, wenn hohe Konzentrationen von Nitrit oder Nitrat zu erwarten sind) von 1 & mgr; M Nitritlösung. In jedem Fall darauf achten, zu warten, bis das Signal auf den Ausgangswert zurückfällt und erwerben dann 1 bis 2 min der Basislinie eine gute Trennung von Peaks zu erreichen.
         Anmerkung: Nitrite Standards können jederzeit während der Experimente gemessen werden. Jedoch ist es bevorzugt, die Standardkurve vor der Datenmessung zu erfassen, da es auch als eine unabhängige Überprüfung der Gerätefunktionalität dient.
         Wenn die Daten erhoben werden, injiziert Probenmenge zu gut ausgeprägten Spitzen führen sollte. Es sollte jedoch im Auge behalten werden, daß der Photomultiplier linear bis zu ~ 800 mV nur ist, so dass keiner der Spitze sollte höher als ~ 700 mV sein. Dies kann entweder erreicht werden, indem der Betrag injizierten Probe abnimmt oder die Probe mit VE-Wasser verdünnt. Jeder Punkt sollte mindestens doppelt gemessen werden.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von Normen gesammelt und fünf verschiedenen Proben. Wie in dieser Figur gezeigt, Photomultiplier Spannung steigt unmittelbar nach nitrithaltigen Lösung (Standards oder Proben) in Reduktionslösung eingespritzt wird und kehrt zu dem Ausgangswert, sobald alle Nitrit in der injizierten (Injektionen Zeiten werden durch rote Pfeile unterhalb der Kurve angegeben) Lösung wurde reduziert. Es ist auch klar aus dieser Figur, die eine...

Diskussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Aliquots aller Lösungen (einschließlich Wasser), die zur Herstellung, verdünnt oder anderweitig Originalproben zu behandeln haben für mögliche Nitrit oder (häufiger) Nitratbelastung gespeichert und überprüft werden. Wir fanden, dass die meisten Verunreinigungen von Wasser kommt, und viele Chemikalien verwendet Probe (ferricyanide insbesondere) zur Behandlung auch erhebliche Menge an Nitratbelastung in einigen Partien enthalten, die mit dem end...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics