מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

Summary

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Abstract

תחמוצת החנקן (NO) הוא אחד מולקולות הרגולטור הראשי הומאוסטזיס וסקולרית וגם מוליך עצבי. NO מיוצר enzymatically מתחמצן לתוך הניטריט ו חנקתי על ידי אינטראקציות עם חלבונים אצטילן-heme שונים ועדיין אחרים לא מסלולים ידועים. התהליך ההפוך, הפחתה של הניטריט ו חנקתי לתוך NO התגלה ביונקים בעשור האחרון והוא צובר תשומת לב כאחד המסלולים ניתן גם למנוע או להקל על מגוון שלם של לב, חילוף חומרים והפרעות שרירים כי הם חשבו להיות מזוהה עם רמות של NO ירד. לכן חשוב לאמוד את הסכום של NO מטבוליטים שלו בתאים שונים בגוף - דם, נוזלי גוף ואת הרקמות השונות. דם, בשל נגישותו הקלה, הוא התא העדיף המשמש להערכת NO מטבוליטים. בשל החיים הקצרים שלה (כמה אלפיות) וריכוז תת-nanomolar נמוך, מדידות אמינות ישירות של דם NO <em> In vivo נוכחי קשיים טכניים נהדרים. לפיכך אין הזמין בדרך כלל מוערך על בסיס הסכום של מוצרי חמצון שלה, הניטריט ו חנק. מטבוליטים אלה שני תמיד נמדדים בנפרד. ישנן מספר שיטות מבוססות היטב כדי לקבוע הריכוזים שלהם נוזלים ביולוגיים ורקמות. כאן אנו מציגים פרוטוקול השיטה chemiluminescence (CL), מבוסס על זיהוי spectrophotometrical של NO לאחר הפחתת ניטריט או ניטראט ידי יודיד תלת או ונדיום (III) פתרונות כלוריד, בהתאמה. רגישות ניטריט וזיהוי חנק נמצאת בטווח nanomolar נמוך, ומגדירת CL כשיטה הרגישה ביותר הקיימים כיום כדי לקבוע שינויי NO מסלולים מטבוליים. אנחנו מסבירים בפירוט כיצד להכין דגימות נוזלים ביולוגיים ורקמות כדי לשמר סכומים מקוריים של ניטריט ובהווה חנק בעת האיסוף כיצד לקבוע את גובה הסכומים שלהם בדגימות. מגבלות הטכניקה CL הם גם explained.

Introduction

ניטריט, וכדי חנק להאריך פחות, רמות בדם משקפים מצב כללי של גוף NO מטבוליזם. ריכוזי ניטריט בדם ורוב האיברים והרקמות הם רק nanomolar גבוהה או טווח מיקרו נמוכה, חנקתי הוא בדרך כלל נוכח כמויות גבוהות בהרבה - בטווח מיקרו. שינויים ברמות ניטריט בשל התקדמות המחלה או שינויים בהרגלי התזונה הם די קטנים וניתן למדוד רק באמצעות שיטה רגישה מאוד. בגלל הרמות מאוד שונות התהליכים מטבוליים שונים שלהם, נחישות נפרדת של רמות ניטריט ניטרט היא חיונית. מה שנקרא "אין בקביעה _x" איפה ניטריט ניטרט נמדדים ביחד יש ערך מועט מאוד.

מספר שיטות לכימות ניטריט ב דגימות ביולוגיות שונות פותחו - הנפוצה ביותר להיות בכור אחד, המבוסס על תגובת Griess אשר תוארה לראשונה בשנת 1879. אפילו עם modificatio המודרניתNS, המגבלה הרגישה ניטריט השגה בשיטה 'Griess נמצאת בטווח מייקרו נמוך. Chemiluminescence (CL), בשילוב עם פתרון להפחתת יודיד תלת, נחשב כיום השיטה הרגישה ביותר, המאפשר כימות בטווח nanomolar נמוכה של ריכוזי ניטריט ^1-8,10,11. השיטה הזהה CL, בשילוב עם ונדיום (III) כלוריד צמצום פתרון, יכולה לשמש למדידות רגישות של חנק, עם דיוק בטווח nanomolar ^9.

CL מזהה NO דלק חינם. לכן, ניטריט, ניטראט, R-nitrosothiols (R-Sno), R-nitrosoamines (R-Nno), או תרכובות מתכת-NO (בהמשך כתב היד המכונה בשם "R- (X) -NO"), חייב להיות מומר לשחרר אין גז על מנת לכמת הסכומים המקוריים שלהם באמצעות CL. המרה ל NO מושגת באמצעות מספר פתרונות לצמצום שונים, בהתאם לאופי של NO המטבוליט. לאחר המרה, גז NO חינם נמחק כליל כלי התגובה ידי גז מוביל (הוא, N2 או Ar) לתוך תא התגובה של מנתח CL שבו אוזון (O ₃₎ בשילוב עם NO ליצירת תחמוצת החנקן (NO ₂₎ במצב מופעל שלה. עם החזרה למצב הקרקע, NO ₂ * פולט באזור אינפרא אדום פוטון שנפלט הוא זוהה על ידי מכפיל (PMT) של מכשיר CL. עוצמת האור הנפלט היא ביחס ישר ל NO ריכוז בתא תגובה, המאפשר חישוב של הריכוז של המינים המקוריים באמצעות עקומות כיול ראויות.

בפרוטוקול שלנו, אנו נחישות CL המבוסס הנוכחית הראשון של הניטריט ו חנק בהגדרות הקליניות הנפוצות ביותר - בדם ופלזמה, ולאחר מכן אנו דנים כיצד לקבוע יונים אלה בדגימות רקמה. אנו גם להסביר בפירוט כיצד לשמר את ריכוז ניטריט הפיזיולוגי המקורי בסביבות ניטריט-reactive, כגון דם והתאים שלה, פלזמה ותא דם אדום.

Protocol

כל הפרוטוקולים כולל השימוש בבעלי חיים אושרו לשימוש על ידי טיפול בבעלי חיים NIDDK ועדת שימוש ודם אדם הושג מבנק דם NIH מתורמים בריאים.

לדוגמא הכנה 1.

1. הכנת פתרון לשימור ניטריט
   1. הכן תמיסה המכילה 890 ferricyanide אשלגן מ"מ (K ₃ Fe (CN) ₆₎ ו -118 מ"מ NEM (N-ethylmaleimide) במים מזוקקים. ממיס היטב עד שברור צהוב ללא גבישים נוכחיים. להוסיף NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) ביחס של 1: (V / V, NP-40 / פתרון) 9 יחס. מערבבים בעדינות כדי למנוע הקצפה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כשבוע).
2. אוסף והכנת דגימות דם
   1. איסוף דם באמצעות לפחות מחט 20 G כדי למנוע המוליזה עם הפרין כדי למנוע קרישה (5 U / ml). עבור כל דגימת הדם, לערבב דם עם שמירת ניטריט פתרון מיידית ביחס של 1: 4 (נ/ V פתרון / דם).
   2. לקבלת דוגמיות פלזמה כדורית דם אדום, בצנטריפוגה הדם שנאסף במשך 5 דקות ב 4000 XG ב 4 ° C להפריד תאי דם אדומים (RBC) ופלזמה. קח את supernatant (פלזמה) ולערבב אותו עם ניטריט שמירת פתרון כפי שתואר לעיל עבור קביעת רמות ניטריט בפלזמה.
   3. מוציאים בזהירות הנותרים מעיל פלזמה באפי מהדגימה, מדגם פיפטה RBC מתחתית הצינור כדי למנוע זיהום על ידי סוגים אחרים של תאי דם באמצעות קצה פיפטה חתוכים, ולהעביר אותו לתוך צינור המכיל פתרון לשימור ניטריט באותו יחס כנ"ל.
   4. מערבבים כל דגימה (פלזמה RBC) עם מתנול קר ביחס 1: 1 או 1: 2 (V / V מדגם / מתנול) צנטריפוגות אותם 13,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לזרז חלבונים. קח את supernatant ולהשתמש בו למדידת ניטריט או להקפיא דגימות מוכנות, במידת צורך, על קרח ולאחסן יבש ב -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניטריט במהירות REACTS עם oxyhemoglobin (oxyHb) ב חנקתי להרכיב דם. מאז oxyHb הוא תמיד נוכח עודף גדול מעל ניטריט, תגובה זו גורמת כמעט מוחלטת השמדת ניטריט דם ילידים עם מסגרת זמן של 10 דקות ~. כדי לשמר את מרבית ניטריט דם אנדוגני, פתרון משמרי ניטריט מתווסף דגימות דם כולו מיד לאחר לקיחת הדם. הפתרון יהיה lyse תאי דם אדומים במהירות לחמצן oxyHb לתוך methemoglobin (metHb), צורה פעילה של המוגלובין שאינו מגיב כימית עם ניטריט.
3. הכנת דגימות מסוגים אחרים של נוזלי גוף
   1. לאחר איסוף מדגם לתוך מיכל מתאים, ומערבבים היטב עם שמירה ניטריט פתרון, deproteinate ולמדוד מיד או להקפיא ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
4. אוסף והכנת דגימות רקמה
   1. דגימות של רקמות חיות perfused עם תמיסת מלח heparinized (10 U HEPAרין / מ"ל). בלו על 1 גרם של רקמות רצויות homogenize או באמצעות homogenizer ידנית או אוטומטית homogenizer.
   2. הוסף ידוע כמות ניטריט שימור פתרון לפי צורך כדי להשיג homogenate החלק.
   3. לאחר הרקמות הן הומוגני, לזרז חלבונים באמצעות מתנול קר (1: 1 או 1: 2 נ יחס / v מדגם / מתנול) כפי שתואר לעיל, אזי דגימות צנטריפוגות ב 13,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
   4. אסוף רמות ניטריט supernatant ולמדוד. במידת הצורך, להקפיא דגימות בכל שלב של הכנה על קרח ולאחסן יבש ב -80 מעלות צלזיוס.

2. הכנת צמצום פתרונות

1. Tri-יודיד (אני ₃₎ צמצום פתרון הניטריט ו R- (X) -NO מינים נחישות ^1,3,4
   1. הכן פתרון של 301 מ"מ KI יחד עם 138 מ"מ לי ₂ פתרון במים. מערבבים עם חומצה אצטית קרחונית ב 2: 7 יחס (v / v פתרון / חומצה) על בוחש מגנטי עבור ~ 30 דקות עד שכלגבישים הם מומסים. רצוי לשמור בבקבוק כהה, כמו יודיד אור רגיש, ולהשתמש תוך שבוע הכנה.
      הערה: פתרון זה יקטין ניטריט לתוך NO וזה גם ישחרר NO מ R-Sno, R-Nno ו Fe-NO קבוצות פונקציונליות (R (X) -NO), אך חנקתי לא יושפע. האות המתקבל ממחשב הקבוצות הפונקציונליות NO המבוסס לעיל ניתן להפריד אות ניטריט נכון על ידי טיפול של מחצית המדגם עם sulfanilamide acidified (AS) והשוואת אות AS שטופל וטופל כראוי. AS באופן בלתי הפיך יוצר קטיון diazonium עם ניטריט ומורכב זה לא יכול להיות מופחת על ידי לי ₃ פתרון. כל טיפול, להכין פתרון 290 מ"מ של sulfanilamide ב 1 M HCl ולהוסיף אותו aliquot של המדגם ביחס 1: 9 (V / V AS / לדוגמה). מדוד את האות CL בחלקים AS שטופלו ומטופלים כראוי של המדגם. חשב את האות ניטריט נכון כהבדל של חלק AS שטופלו ומטופלים כראוי של המדגם. ניטריט ניתן גם נמדד באמצעות ניט סלקטיביתטקס צמצום פתרון של תערובת חומצה אסקורבית / אצטית כמתואר חלק 2.2. עם זאת, בשל כמות בדרך כלל קטנה של R- (X) -NO מינים בהווה, מדידות באמצעות דגימות AS-מטופל הם ברוב המקרים קירוב טוב מאוד של תוכן ניטריט הכולל.
2. חומצת אסקורבית / חומצה אצטית (4A) פתרון זיהוי סלקטיבית של ניטריט ²
   1. כן 500 מ"מ חומצה אסקורבית במים. מערבבים את הפתרון הזה עם חומצה אצטית קרחונית על יחס 1: 7 (V / V, חומצה אסקורבית / חומצה אצטית) כדי להכין את תערובת התגובה.
      הערה: פתרון זה הוא ספציפי עבור ניטריט, לא תשחרר NO מכל R- (X) -NO מינים או ניטראט. עם זאת, הפתרון של אסקורבית וחומצה אצטית חייב להיות מוכן טרי כל יום לפני המדידות, כמו חומצה אסקורבית מתחמצנת בקלות בתמיסה.
      השלמתי הפחתת ניטריט תלוי בריכוז חומצת אסקורבית; ולפחות חומצה אסקורבית 50 מ"מימ מומלצת לחדרים מלאיםeduction של ניטריט פלזמה. עם זאת, מומלץ לבצע כמה ניסויי טייס עם ריכוזים שונים של חומצה אסקורבית וסטנדרטים ניטריט בטווח ריכוז ניטריט הצפוי לפני מדידות מדגם סופיות. זכור כי חומצה אסקורבית מהכלה מעט במהלך המדידות, כך שינויים תכופים של תערובת תגובה בתא תגובת זכוכית מומלצים.
3. ונדיום (III) פתרון צמצום כלוריד לקביעה חנק ⁹
   1. כן 51 מ"מ פתרון של VCL ₃ ב 1 M HCl. פתרון סינון דרך 200 מיקרומטר מסנן ולאחסן בבקבוק כהה, השתמש בתוך שבועיים.
      הערה: פתרון זה יקטין חנק, ניטריט וכל R- (X) -NO מינים, כך שאם בכמויות דומות של ניטריט או R- האחר (X) -NO מינים נמצאים יחד עם חומר נפץ, התוכן חנק סופית שיחושב כהפרש בין אותות CL שהושג עם VCL ₃ ואני₃ צמצום פתרונות.

3. chemiluminescence (CL) Setup ומדידות Analyzer

1. פתרון רגיל
   1. כן 1 מיקרומטר פתרון של סודיום ניטריט (Nano _2). אותו הפתרון יכול לשמש קביעות הניטריט ו חנק.
2. שימוש NO מנתח
   הערה: בשלב זה יש שני מנתחים זמינים אין מסחרי רגישים מספיק למטרות מחקר ביולוגיות - סיברס נוע Ecophysics CLD 88Y. שניהם פועלים על אותו העיקרון; ההבדל העיקרי הוא כי CLD 88Y משתמשת חמצן מאוויר המקום לעשות אוזון (O _3), בעוד NOA דורש מיכל חמצן חיצוני למטרה זו. ההליך שלהלן מתאר את להגדיר עבור סיברס NOA.
   1. התקנת Instrument
      1. בצע את ההגדרה הראשונית של NO מנתח על פי המלצות היצרןכפי שאפשר לראות על איור 1.
      2. טנק להרחיב O ₂ מחובר המכשיר. בחר "ניתוח" ו "להיכנס" מהתפריט הראשי בלוח הקדמי. במסך הבא לבחור "התחל" ולחץ על "Enter." חבר את מלכודת חומצה (המכיל 1 M NaOH) למכשיר כפי שניתן לראות באיור 1.
      3. חכה עד המכפיל מתקרר לטמפרטורה מתחת -12 מעלות צלזיוס בתא התגובה יפונה עד 6 Torr. זה לוקח בערך 30 דקות כדי להגיע בסיס שטוח ויציב. הבסיס צריך לייצב בתוך 1 - 2 mV, בערכו הנקוב הוא פחות חשוב מאשר את יציבותו.
         הערה: אם חנק נמדדת, להדליק את באמבט מי קירור (להגדיר ב 4 ° C, אשר ממשמש מלכודת קרה עבור אדי חומצה ומים) באמבט מי חימום (תא התגובה העיקרי, 95 ° C). שיעור ההפחתה של חנק לתוך NO בתמיסת VCL ₃ הוא טמפרטורה תלויה, הוא איטי מאוד בטמפה בחדרrature, כך עלייה משמעותית של הטמפרטורה יש צורך לבחון את התגובה.
      4. פתח את הטנק הוא וחברת את תא תגובת זכוכית, ללכוד חומצה כפי שאפשר לראות על איור 1. ממלא את חדר התגובה עם פתרון הפחתה מתאים, להפחית את המבעבע למינימום ולהתחבר תא תגובה למלכודת החומצה. באמצעות ניסוי וטעייה, להתאים את קצב מבעבע הוא להתאים את קצב שאיבה מכשיר (בדרך כלל ~ 200 מ"ל / דקה של NOA Siever).
      5. הפעל את מחשב שליטה המכשירה ולהתחיל תוכנה נוזלית מבוססת Labview. כדי להפעיל את התקשורת בין המכשיר ואת תוכנת הרכישה, לחץ על "זן" כאשר "בתפריט נתונים" עד מסך קורא "פלט מופעל", ולאחר מכן קש "ברור" לחזור שוב אל מסך נתונים.
      6. חכה שמץ בסיס יציב על המסך ולהתחיל הזרקת דגימות וסטנדרטים ניטריט בדבר הפחתת פתרון באמצעות מחץ. תמיד לחכות להגיע ומאחור בסיס יציבאה השיא. זה יכול להימשך עד 2 דקות. התוכנה הנוזלת אופציה "סימן" בעתות הזרקה ותסמן את הזריקה וזה יהיה לייצא הערות אלה לקובץ נפרד (filename.info) כהשלמה שימושית לקובץ הנתונים (filename.data).
      7. לאחר דגימות וסטנדרטים נמדדים, לבחור "להפסיק" אפשרות בתפריט התוכנה נוזלי - זה יכתוב נתונים מקובץ זמני לקובץ קבוע, הידוע בשם "filename.data". "להפיל" לחיצת אפשרות תסתיים מדידה מבלי לכתוב נתונים רכשו לקובץ קבע.
      8. כדי לסיים את הניסוי, לנתק את המכונית מספינת התגובה ידי כיבוי הברזלים על גבי כלי תגובה וניתק את הצינורות בין מלכודת חומצת כלי תגובה (ראה איור 1). עכשיו להפסיק מנתח NOA - עיתונות "ברור", ללכת "ניתוח", לשים מכונים על "מתנה" מתנה "אישור". אם נעשה שימוש קבוע,מכשיר ניתן להשאיר במצב המתנה במשך כמה שבועות. סגור את אספקת החמצן. ואז לשטוף את הפתרון לצמצום מאולם התגובה, ניתק ולסגור את הטנק הוא מספינת תגובת הזכוכית לסיים את ניקוי כלי תגובה.
   2. לתקני זריקות מדגם
      1. להזריק 50 μl של פתרון ניטריט 1 מיקרומטר לתוך תערובת התגובה באמצעות מזרק המילטון היטב שטף. חכו לפחות 1 - 2 דקות בין זריקות כדי להשיג הפרדה טובה של פסגות. הזרקת חזור של 50 μl לקבל כפילויות לכל נקודת נתונים. לשטוף מזרק עם מים ללא יונים לאחר כל הזרקה.
      2. כדי לרכוש סט מלא של נתונים עבור עקומה סטנדרטית, להמשיך עם זריקות כפולות של 100, 150 μl (נוספים 200 μl עשויים להידרש אם ריכוזים גבוהים של ניטריט או ניטראט צפויים) של פתרון ניטריט 1 מיקרומטר. בכל מקרה, לטפל לחכות עד האות נופלת חזרה אל הבסיס ולאחר מכן לרכוש 1 - 2 מילn של הבסיס כדי להשיג הפרדה טובה של פסגות.
         הערה: תקני ניטריט יכול להימדד בכל עת במהלך הניסויים. עם זאת, עדיף לרכוש את עקומת סטנדרט לפני המדידה הנתונים, כפי שהוא משמש גם בדיקה עצמאית של פונקציונליות המכשיר.
         כאשר נתונים נאספים, כמות המדגם מוזרקת צריכים להוביל פסגות מבוטאות היטב. עם זאת יש לזכור כי מכפיל הוא ליניארי רק עד ~ 800 mV, כך שאף אחד השיא צריך להיות גבוה יותר מ ~ 700 mV. זו יכולה להיות מושגת באמצעות הפחתה של מדגם מוזרק כמות או דילול מדגם עם מים ללא יונים. כל נקודה יש ​​למדוד לפחות בשני עותקים.

תוצאות

איור 2 מציג תוצאות נציגים שנאספו סטנדרטים וחמישה מדגמים שונים. כפי שניתן לראות בנתון זה, עליות מתח מכפיל מייד לאחר ניטריט המכיל פתרון (תקני או דוגמאות) מוזרקות צמצום פתרון (פעמי זריקות מסומנות על ידי חצים אדומים מתחת העקומה) וחוזר לערך הבסיס...

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

Aliquots של כל הפתרונים (כולל המים) המשמשים להכנה, לדלל או אחרת לטיפול דגימות מקוריות צריך להישמר ובדק עבור ניטריט האפשרי או (לעתים קרובות יותר) זיהום חנק. גילינו כי רוב זיהום מקורם במים רבים כימיקלים המשמש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics