La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Resumen

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Resumen

El óxido nítrico (NO) es una de las principales moléculas de regulador en la homeostasis vascular y también un neurotransmisor. producido enzimáticamente NO se oxida en nitrito y nitrato por interacciones con diversas proteínas oxi-hemo y otras vías todavía no bien conocidas. El proceso inverso, la reducción de nitrito y nitrato en NO había sido descubierto en mamíferos en la última década y que se destaca por ser una de las posibles vías para prevenir o aliviar una amplia gama de enfermedades cardiovasculares, metabólicas y trastornos musculares que se cree estar asociado con niveles disminuidos de NO. Por tanto, es importante para estimar la cantidad de NO y sus metabolitos en diferentes compartimentos del cuerpo - la sangre, fluidos corporales y los diversos tejidos. La sangre, debido a su fácil accesibilidad, es el compartimiento preferido utilizado para la estimación de metabolitos de NO. Debido a su corta vida (pocos milisegundos) y baja concentración sub-nanomolar, mediciones fiables directas de sangre NO <em> in vivo presentan grandes dificultades técnicas. Por lo tanto la disponibilidad de NO se estima por lo general basado en la cantidad de sus productos de oxidación, nitrito y nitrato. Estos dos metabolitos siempre se miden por separado. Hay varios métodos bien establecidos para determinar sus concentraciones en los fluidos y tejidos biológicos. Aquí se presenta un protocolo para el método de quimioluminiscencia (CL), basado en la detección espectrofotométrico de NO después de nitrito o nitrato de reducción por (III) soluciones de cloruro de tri-yoduro o vanadio, respectivamente. La sensibilidad para la detección de nitrito y nitrato está en la gama baja nanomolar, que establece CL como el método más sensible disponible actualmente para determinar los cambios en las rutas metabólicas NO. Explicamos en detalle cómo preparar muestras de fluidos y tejidos biológicos con el fin de preservar el valor de origen de nitritos y nitratos presentes en el momento de la recogida y la forma de determinar sus respectivas cantidades en las muestras. Las limitaciones de la técnica CL también son explained.

Introducción

Nitrito y nitrato a un menos extender, los niveles en la sangre refleja el estado general del cuerpo NO metabolismo. las concentraciones de nitrito en la sangre y la mayoría de los órganos y tejidos son sólo en alta nanomolar o rango micromolar bajo, el nitrato es por lo general presentes en cantidades mucho más elevadas - en el rango micromolar. Los cambios en los niveles de nitritos debido a la progresión de la enfermedad o los cambios en los hábitos alimenticios son bastante pequeñas y sólo pueden ser medidos usando un método muy sensible. Debido a sus muy diferentes niveles y diferentes procesos metabólicos, determinación separada de los niveles de nitrito y nitrato es esencial. El llamado "NO determinación _x", donde nitritos y nitratos se mide en conjunto tiene muy poco valor.

Se han desarrollado varios métodos para la cuantificación de nitrito en diversas muestras biológicas - siendo el más común el más antiguo, en base a la reacción de Griess que había sido descrito originalmente en 1879. Incluso con modificatio modernons, el límite de sensibilidad para el nitrito alcanzable por el método de Griess 'está en el rango bajo micromolar. Quimioluminiscencia (CL), combinado con tri-yoduro de solución reductora, se considera actualmente el método más sensible, lo que permite la cuantificación en el intervalo nanomolar bajo de concentraciones de nitrito ^1-8,10,11. El mismo método CL, en combinación con vanadio (III) cloruro solución reductora, se puede utilizar para mediciones sensibles de nitrato, con precisión en el rango nanomolar ^9.

CL detecta gas libre NO. Por lo tanto, nitrito, nitrato, R-nitrosotioles (R-SNO), R-nitrosaminas (R-NNO), o compuestos de metal-NO (más adelante en el manuscrito que se refiere como "R- (X) -NO"), deben ser convertidos en liberar el gas NO con el fin de cuantificar su valor de origen a través de CL. La conversión a NO se consigue utilizando varias soluciones de reducción diferentes, dependiendo de la naturaleza de la NO metabolito. Después de la conversión, libre de gas NO se purga del recipiente de reacción por un gas portador (He, N2 o Ar) en la cámara de reacción del analizador CL donde el ozono (O ₃₎ se combina con el NO para formar dióxido de nitrógeno (NO ₂₎ en su estado activado. Con el retorno al estado fundamental, _NO2 * emite en la región del infrarrojo y fotón emitido es detectado por fotomultiplicador (PMT) del instrumento CL. La intensidad de la luz emitida es directamente proporcional a la concentración de NO en la cámara de reacción, que permite el cálculo de la concentración de la especie original utilizando curvas de calibración adecuados.

En nuestro protocolo, que la determinación basada en CL primer regalo de nitrito y nitrato en los entornos clínicos más utilizados - en la sangre y el plasma, y ​​luego se discute cómo determinar estos iones en muestras de tejido. También explicamos en detalle cómo conservar la concentración de nitrito fisiológico original en entornos de nitrito-reactivos, tales como la sangre y sus compartimentos, plasma y células rojas de la sangre.

Protocolo

Todos los protocolos que incluyen el uso de animales fueron aprobados para su uso por NIDDK Cuidado de Animales y el empleo y se obtuvo sangre humana a partir de bancos de sangre de donantes sanos NIH.

1. Preparación de muestras

1. Preparación de solución de nitrito de preservar
   1. Preparar una solución que contiene 890 mM de ferricianuro de potasio (K ₃ Fe (CN) ₆₎ y NEM mM 118 (N-etilmaleimida) en agua destilada. Disolver bien hasta que quede claro de color amarillo sin cristales presentes. Añadir NP-40 (octil phenoxylpolyethoxylethanol) en una relación 1: 9 (v / v, NP-40 / solución). Mezclar suavemente para evitar la formación de espuma y se almacena a 4 ° C durante aproximadamente una semana).
2. Recogida y preparación de muestras de sangre
   1. Recoger la sangre usando al menos una aguja de 20 G para evitar la hemólisis con heparina para evitar la coagulación (5 U / ml). Para la muestra de sangre, se mezcla la sangre con nitrito de solución de conservación inmediatamente en una proporción de 1: 4 (v/ V / solución de sangre).
   2. Para las muestras de plasma y células rojas de la sangre, se centrifuga la sangre recogida durante 5 minutos a 4000 xga 4 ° C para separar las células rojas de la sangre (RBC) y plasma. Tome el sobrenadante (plasma) y se mezcla con nitrito de solución de conservación como se describe anteriormente para la determinación de los niveles de nitrito en plasma.
   3. Retire cuidadosamente el plasma y la capa leucocitaria de la muestra y la pipeta de muestra RBC desde la parte inferior del tubo restante para evitar la contaminación por otros tipos de células de la sangre utilizando una punta de pipeta de corte, y la transfiere en un tubo que contiene solución de conservación de nitrito en el mismo relación que anteriormente.
   4. Mezclar cada muestra (plasma y RBC) con metanol frío con una relación de 1: 1 o 1: 2 (v / v de la muestra / metanol) y se centrifuga a 13.000 xg ellos a 4 ° C durante 15 min para precipitar las proteínas. Tomar el sobrenadante y utilizarlo para la medición de nitritos o congelar muestras preparadas, si es necesario, en hielo seco y almacenar a -80 ° C.
      Nota: El nitrito rea rápidamentects con la oxihemoglobina (oxiHb) de nitrato de formación de sangre. Desde oxiHb siempre está presente en gran exceso sobre el nitrito, esta reacción conduce a la aniquilación casi completa de nitrito de sangre nativa con un marco de tiempo de ~ 10 min. Con el fin de preservar la mayor parte de nitrito de sangre endógena, se añadió una solución de nitrito de preservación de las muestras de sangre inmediatamente después de la extracción de sangre. La solución lisar rápidamente glóbulos rojos y oxidar oxiHb en metahemoglobina (metahemoglobina), una forma inactiva de la hemoglobina que no reacciona químicamente con nitrito.
3. Preparación de las muestras de otros tipos de fluido corporal
   1. Después de la recogida de la muestra en un recipiente adecuado, mezclar bien con nitrito de preservar la solución, y medir deproteinate inmediatamente o congelar y almacenar a -80 ° C.
4. Recogida y preparación de muestras de tejido
   1. Recoger tejidos de animales perfundidos con solución salina heparinizada (10 U HEPArin / ml). Impuestos Especiales sobre 1 g de tejido deseado y homogeneizar, ya sea usando un homogeneizador manual o un homogeneizador automatizado.
   2. Añadir cantidad conocida de nitrito de solución de conservación según sea necesario para lograr homogeneizado suave.
   3. Una vez que el tejido se homogeneiza, precipitar proteínas utilizando metanol frío (1: 1 o 1: 2 relación v / v de la muestra / metanol) como se describió anteriormente, las muestras de centrifugar a 13.000 xg a 4 ° C durante 15 min.
   4. Recoge los niveles de nitrito sobrenadante y medida. Si es necesario, congelar las muestras en cualquier etapa de la preparación en hielo seco y almacenar a -80 ° C.

2. Preparación de soluciones reductoras

1. Tri-yoduro (I ₃₎ la reducción de solución de nitrito y R- (X) -NO especies determinación ^1,3,4
   1. Preparar una solución de KI 301 mM junto con una solución de 138 mM I ₂ en agua. Mezclar con ácido glacial acético en proporción de 2: 7 (v / v / solución de ácido) en un agitador magnético durante ~ 30 min hasta que todocristales se disuelven. Preferiblemente tener en botella oscura, como yoduro es sensible a la luz, y el uso dentro de una semana desde su preparación.
      Nota: Esta solución reducirá el nitrito en NO y que también dará a conocer NO a partir de R-SNO, R-NNO y NO-Fe grupos funcionales (R- (X) -NO), pero el nitrato no se verá afectada. La señal de los grupos funcionales basados ​​en NO anteriores se puede separar de la verdadera señal de nitrito por tratamiento de la media de la muestra con sulfanilamida acidificada (AS) y comparar AS tratada y la señal no tratada. AS irreversiblemente forma catión diazonio con nitrito y este complejo no puede ser reducida por I ₃ solución. Porque así como el tratamiento, preparar una solución 290 mM de sulfanilamida en HCl 1 M y añadirlo a una parte alícuota de la muestra en relación 1: 9 (v / v AS / muestra). Medir la señal CL en piezas tratadas y sin tratar AS-de la muestra. Se calcula la verdadera señal de nitrito como una diferencia de parte tratada y no tratada AS-de la muestra. El nitrito puede ser también midió mediante el uso de una liendre selectivaRite-reducción solución de mezcla de ácido ascórbico / ácido acético como se describe en la parte 2.2. Sin embargo, debido a la generalmente pequeña cantidad de R- (X) -NO especies presentes, las mediciones usando muestras AS-no tratados son en la mayoría de los casos una muy buena aproximación del contenido total de nitrito.
2. / Solución de ácido acético (4A) de ácido ascórbico para la determinación selectiva de nitrito de ²
   1. Preparar ácido ascórbico 500 mM en agua. Mezclar esta solución con ácido acético glacial en una relación 1: 7 (v / v, ácido ascórbico / ácido acético) para preparar la mezcla de reacción.
      Nota: Esta solución es específico para el nitrito, no va a liberar NO desde cualquier R- (X) -NO especies o nitrato. Sin embargo, la solución de ácido ascórbico y ácido acético debe prepararse poco antes de cada día de las mediciones, como el ácido ascórbico se oxida fácilmente en solución.
      La finalización de la reducción de nitrito depende de la concentración de ácido ascórbico; y ácido ascórbico al menos 50 mm se recomienda para r completaeducción de nitrito de plasma. Sin embargo, se recomienda llevar a cabo unos experimentos piloto con diferentes concentraciones de ácido ascórbico y normas de nitritos en el rango de concentración de nitrito esperado antes de las mediciones de muestras finales. Tenga en cuenta que el ácido ascórbico reduce ligeramente durante las mediciones, se recomiendan cambios tan frecuentes de mezcla de reacción en la cámara de reacción de vidrio.
3. El vanadio (III) cloruro de solución reductora para la determinación de nitrato de ⁹
   1. Preparar la solución de 51 mM de _VCl3 en HCl 1. Filtrar la solución a través de filtro de 200 micras y guardar en un frasco oscuro, utilice el plazo de dos semanas.
      Nota: Esta solución reducirá nitrato, nitrito y todo R- (X) -NO especies, por lo que si cantidades comparables de nitrito u otro R- (X) -NO especies están presentes junto con el nitrato, el contenido final de nitrato tienen que ser calculados como la diferencia entre las señales CL obtenidos con VCl ₃ y I₃ la reducción de las soluciones.

3. La quimioluminiscencia (CL) de configuración del analizador y Medidas

1. Solucion estandar
   1. Preparar 1 M solución de nitrito sódico _(NaNO2). La misma solución se puede utilizar para las determinaciones de nitrito y nitrato.
2. El uso de analizador de NO
   Nota: En la actualidad hay dos disponibles comercialmente NO analizadores que son lo suficientemente sensibles como para fines de investigación biológica - Sievers NOA y 88Y Ecophysics EPC. Ambos operan en el mismo principio; la principal diferencia es que la EPC 88Y utiliza el oxígeno del aire de la habitación para que el ozono (O _3), mientras que NOA requiere un tanque de oxígeno externo para este propósito. El procedimiento siguiente describe la puesta en marcha de la Sievers NOA.
   1. configuración del instrumento
      1. Realizar una configuración inicial de la analizador de NO de acuerdo con las recomendaciones del fabricanteSegún lo visto en la Figura 1.
      2. Abrir _O2 depósito conectado al instrumento. Elija "análisis" y "entrar" en el menú principal en el panel frontal. En la siguiente pantalla seleccione "Iniciar" y pulse "enter". Conectar la trampa ácido (que contiene NaOH 1 M) en el instrumento como se ve en la Figura 1.
      3. Esperar hasta fotomultiplicador se enfría a temperatura por debajo de -12 ° C y la cámara de reacción se evacua a 6 Torr. Se tarda unos 30 minutos para llegar a una línea de base plana y estable. La línea de base necesita para estabilizar dentro de 1 - 2 mV, su valor nominal es menos importante que su estabilidad.
         Nota: Si se mide el nitrato, encender el baño de enfriamiento de agua (establecido a 4 ° C, la cual sirve como trampa fría para ácidos y vapores de agua) y el baño de agua de calentamiento (la cámara de reacción principal, 95 ° C). La velocidad de la reducción de nitrato en NO en solución VCl ₃ es dependiente de la temperatura, y es muy lento a tempe habitacióntura, por lo que se necesita aumento sustancial de la temperatura para observar la reacción.
      4. Se abrirá el tanque y conecte la cámara de reacción de vidrio para atrapar el ácido como se ve en la Figura 1. Llenar la cámara de reacción con una solución de reductor apropiado, reducir la formación de burbujas al mínimo y conecte la cámara de reacción a la trampa de ácido. El uso de ensayo y error, ajustar la velocidad de burbujeo Él para que coincida con la velocidad de aspiración instrumento (normalmente ~ 200 ml / min para el NOA de Siever).
      5. Encienda el ordenador que controla el instrumento e inicie el software líquido basado en Labview. Para activar la comunicación entre el instrumento y el software de adquisición, pulse "enter" cuando en "menú de datos de" hasta que la pantalla se lee "activar la salida", a continuación, presione "claro" para volver de nuevo a la pantalla de datos.
      6. Esperar a que una traza de línea de base estable en la pantalla y comenzar la inyección de las muestras y patrones de nitrito en la reducción de solución a través del septum. Siempre esperar a llegar a una línea de base estable popaer el pico. Esto puede tardar hasta 2 minutos. El software de líquido tiene una opción para "marcar" los tiempos de inyección y anotar la inyección y se exportará estos comentarios en un archivo separado (filename.info) como un complemento útil para el archivo de datos (filename.data).
      7. Una vez que se miden las muestras y patrones, elegir la opción "parada" opción en el menú del software Liquid - esto va a escribir los datos de un archivo temporal en un archivo permanente conocida como "filename.data". Al pulsar la opción de "abortar" terminará la medición sin necesidad de escribir los datos adquiridos en un archivo permanente.
      8. Para terminar el experimento, desconectar la máquina de la vasija de reacción apagando la llave de paso en la parte superior del recipiente de reacción y desconectar el tubo entre la trampa y ácido recipiente de reacción (véase la Figura 1). Ahora deja de analizador de NOA - presione "claro", vaya a "análisis", máquina de poner en "espera" y espera "confirmar". Si se usa con regularidad, lainstrumento puede dejarse en modo de espera durante varias semanas. Cierre el suministro de oxígeno. A continuación, enjuagar la solución reductora de la cámara de reacción, de desconexión y cierre del depósito de Él del recipiente de reacción de vidrio y termine de limpiar recipiente de reacción.
   2. Normas y inyecciones de muestra
      1. Inyectar 50 l de solución de nitrito de 1 mM en la mezcla de reacción usando una jeringa Hamilton bien lavada. Espere por lo menos 1 - 2 minutos entre cada inyección para lograr una buena separación de los picos. repetición de la inyección de 50 l para obtener duplicados a cada punto de datos. Lavar la jeringa con agua desionizada después de cada inyección.
      2. Para adquirir un conjunto completo de datos para la curva estándar, continuar con las inyecciones duplicadas de 100, 150 l (200 l adicionales podrían ser necesarias si se espera que las altas concentraciones de nitrito o nitrato) de solución de nitrito de 1 mM. En cada caso, tenga cuidado que esperar hasta que la señal pasa de nuevo a la línea de base y luego adquirir 1 - 2 millasn de la línea de base para lograr una buena separación de los picos.
         Nota: las normas de nitrito se pueden medir en cualquier momento durante los experimentos. Sin embargo, es preferible adquirir la curva estándar antes de la medición de datos, ya que también sirve como un control independiente de la funcionalidad de instrumento.
         Cuando se recogen los datos, cantidad de muestra inyectada debería conducir a picos bien pronunciadas. Sin embargo se debe tener en cuenta que el fotomultiplicador es lineal sólo hasta ~ 800 mV, por lo que ninguno del pico debe ser superior a ~ 700 mV. Esto se puede lograr ya sea por la disminución de la cantidad inyectada de la muestra o la dilución de la muestra con agua desionizada. Cada punto se debe medir al menos por duplicado.

Resultados

Figura 2 muestra resultados representativos obtenidos de normas y cinco muestras diferentes. Como se muestra en esta figura, los aumentos de tensión fotomultiplicador inmediatamente después de que se inyecta la solución (estándares o muestras) que contiene nitrito en la reducción de la solución (inyecciones veces se indican mediante flechas rojas debajo de la curva) y vuelve al valor de referencia una vez que todo el nitrito presente en el inyectado solución se re...

Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Las alícuotas de todas las soluciones (incluyendo el agua) que se usan para preparar, diluir o tratar de otro modo las muestras originales tienen que ser guardados y revisados ​​para su posible nitrito o (más a menudo) la contaminación por nitratos. Encontramos que la mayoría contaminación proviene del agua y muchos productos químicos utiliza para tratar la muestra (ferricianuro en particular) también contiene cantidad significativa de contami...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385
sulfanilamide; AS	Sigma	S9251
HCl	Sigma	H1758
acetic acid, glacial	Sigma	A9967
ascorbic acid	Sigma	A7506
potassium iodide; KI	Sigma	60399
iodine; I2	Sigma	207772	light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2	Sigma	563218
vanadium(III) chloride; VCl3	Sigma	208272	ligt sensitive, toxic
GentleMac	Miltenyi
Sievers NOA 280i	GE
CLD 88Y	Ecophysics