زيادة وقت الاسترداد وانخفاض إدارة LPS لدراسة آليات تحفيز عصب فاجوس في الاستجابات الالتهابية محدودة

Summary

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Abstract

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Introduction

توفر الحصانة الفطرية على السطر الأول الفوري للدفاع ضد العدوى والأمراض في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. ليس فقط أنه يبدأ الاستجابة المناعية الأولية للقضاء على التهديد، ولكنه أيضا يلعب دورا محوريا في تفعيل وتثقيف حصانة التكيفية التي تنفذ الاستجابات المناعية الثانوية بطريقة الممرض محددة. ومدبرة التهاب مجموعة كبيرة من السيتوكينات و chemokines، والتي بدورها لديها القدرة على جذب الخلايا المناعية الأخرى إلى موقع الإصابة وللحث على علامات رئيسية من التهاب، مثل احمرار، تورم، ألم، وفقدان الوظيفة، والحمى . مدة وشدة الالتهاب تعتمد على عدة عوامل، ولكن حل الالتهاب واستعادة التوازن هو خطوة حاسمة لتجنب ظهور الأمراض الالتهابية المزمنة. وقد تكشفت التطورات الحديثة في مجال علم الأعصاب وعلم المناعة الآليات العصبية المحددة مع الإمكانات العلاجية الهائلة للسيطرة على inflammation سواء في الجهاز العصبي المركزي وفي الهامش. واحدة من هذه الآليات هو الكوليني المضادة للالتهابات مسار (CAP)، المعروف أيضا باسم منعكس التهابات، التي يقودها الجهاز العصبي اللاإرادي ^{4 و 5.}

ويعتقد حاليا أن وسطاء التهابات تنشيط الأعصاب الحسية وترسل إشارات بشأن حالة التهاب في الجهاز العصبي المركزي. ثم يتم تنشيط استجابة رد الفعل من خلال العصب المبهم صادر. كشفت دراسة موسعة على التفاصيل التشريحية للCAP نموذج السمبتاوي-متعاطفة تتألف من اثنين من الأعصاب، والعصب المبهم وعصب الطحال، على التوالي ^6. في CAP، ينتهي الكوليني العصب المبهم صادر تفعيلها في العقدة-الاضطرابات الهضمية المساريقي، مما أدى إلى تنشيط العصب الطحال الأدرينالية من خلال آلية لم يتم اكتشافها بعد. ومن المعروف أن العصب الطحال، وبالتالي تفعيلها، إلى الداخليةفاتي على مقربة من الخلايا المناعية في اللب الأبيض، منطقة هامشية، واللب الأحمر في الطحال، وأصل الدين والجهاز الإلزامي للCAP ^{7 و 8.} بافراز (NE) من النهايات العصبية الطحال بربط المقابلة مستقبلات الأدرينالية β ₂ أعرب عن الخلايا الليمفاوية T الطحال. هذا يدفع كولين أستيل ترانسفيراز (الدردشة) أستيل بوساطة (ACH) الإفراج عنهم، وهذا بدوره ينشط α7 مستقبلات النيكوتين أستيل (α7nACh) على الضامة، مما يحد من إنتاج السيتوكينات والتهاب ^2. ونتيجة لذلك، فمن الواضح الآن أن الجهاز العصبي هو قادرة على تنظيم الالتهاب في الأنسجة الطرفية واستعادة توازن المناعة المحلي.

كاسم مسار يوحي، ونظام أدن تشافيز له أهمية مركزية لعمل هذا التنظيم مسار الاعصاب المناعي. ومن المثير للاهتمام، والآليات التي تشارك في تفعيليبدو أن CAP أن تكون مختلفة في محيط وفي الجهاز العصبي المركزي. وفي الوقت الذي ظهر على أهمية مستقبلات النيكوتين (α7nAChR) في الطحال في وقت سابق من ⁹ مستقبلات المسكارينية (mAChR) إلزامية لتفعيل المركزي للمسار ^{10 و 11.} وفي الآونة الأخيرة، والإدارة الطرفية من المفعول مركزيا M1 ناهض المسكارينية قمعت بشكل ملحوظ في الدم وورم الطحال عامل نخر α (TNFα) خلال endotoxemia الفئران القاتل، وهو العمل الذي يتطلب العصب المبهم سليمة والعصبية الطحال مما يشير إلى ^12. لقد أظهرنا أيضا في الآونة الأخيرة أن الفئران التي تفتقر إلى البروستاجلاندين E ₂ (PGE ₂₎ لم تكن قادرة على الاستجابة لتحفيز العصب المبهم، ولم أسفل تنظم إطلاق سراح الناجم LPS-السيتوكينات في المصل والطحال ^3. ولذلك، فإن CAP ويمكن أيضا أن ينظم من قبل أنظمة أخرى غير pathw أدن تشافيز الرئيسيةعبد المنعم يوسف.

وقد سميت العصب المبهم على هذا النحو لأنه بطبيعة الحال تجول في الجسم، والتعصيب الأجهزة الرئيسية بما فيها الكبد والرئة والطحال والكلى والأمعاء ^13. النظر في هذا تعصيب كبير وتأثير مناعة قوية جدا من العصب المبهم، فإن إمكانيات العلاجية للCAP تغطي مجموعة واسعة من الحالات الالتهابية. العصب المبهم يمكن أن يكون كهربائيا (أو ميكانيكيا) تنشيط، مع السيطرة على الجهد والتردد، والعكس مع العلاج التقليدي، مع عدم وجود الأدوية إضافة إلى الجسم. هي المحاكمات الجارية حاليا في مرضى الروماتيزم، على سبيل المثال، لاختبار الأهمية السريرية لVNS في علاج التهاب مزمن ^14. وإجمالا، فإن البلاغ والسيطرة على الالتهاب العصبي المناعي حاليا قيد التحقيق، والذي سيوفر إمكانية علاج بديلة للعلاج التقليدي. لذلك، وتحليل العصب المبهم stimulatioتأثير ن في أجهزة معصب مختلفة، ولكن أيضا توصيف عمل العلاجية المحتملة في نماذج حيوانية من التهاب مزمن، بالتأكيد تعطي رؤى ويأمل لأهداف علاجية جديدة محتملة.

منهجية الأصلية التي وضعتها تريسي وزملاؤه ⁴ لا يمكن نقلها إلى مجالنا من الأبحاث بسبب فرط الاستجابة الالتهابية (عن طريق جرعة قاتلة من LPS) ونطاق زمني قصيرة جدا بين تفعيل CAP وقراءة المغادرة. في هذه الورقة، وسوف نقدم التغييرات التي أدخلت على بروتوكول الأصلي، مقارنة بين المنهجيات المختلفة على مستويات خلوى، وتسليط الضوء على مراقبة جديدة ومعاكسة على الجهاز المستهدف (الطحال).

Protocol

تم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية في معهد كارولينسكا في ستوكهولم. التالي لجنة الأخلاقيات المحلية توجيهات الاتحاد الأوروبي بشأن رعاية الحيوان.

ملاحظة: التغييرات الرئيسية من البروتوكول الأصلي هي فترة النقاهة بعد الجراحة (6 ساعات مقابل 1 ساعة) ومستوى LPS حقن (2 ملغ / كغ مقابل 15 ملغ / كلغ). وبخلاف ذلك، لم يتم تغيير إعدادات مختلفة تتعلق الجراحة نفسها.

1. إعداد المواد اللازمة لتحفيز

1. بدوره على جهاز الكمبيوتر ونظام الحصول على البيانات المرتبطة إلى تحفيز الكهربائي (الشكل 1A).
2. أدخل نعترف البرنامج.
3. إعداد محلول المخزون من LPS بتركيز 5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني 1X، قسامة عليه، وتخزينها في -20 ° C. في يوم من التجربة، وذوبان الجليد قسامة وإعداد اديعينة quate من LPS (0.5 ملغ / مل) من أجل ضخ حوالي 100 ميكرولتر في الحيوان، وفقا للوزن.

2. إعداد الحيوان للتخدير

1. استخدام C57BL / 6 الفئران. المحافظة عليها في ظل ظروف المناخ التي تسيطر عليها مع ضوء لمدة 12 ساعة / دورة الظلام، وإطعامهم طعام القوارض القياسية، ومنحهم المياه libitum الإعلانية.
2. إجراء عمليات جراحية على الفئران التي تزن حوالي 25 غراما في اليوم من هذه التجربة.
   ملاحظة: عندما يتم بفعل التفاعلات الالتهابية، من المهم بصفة خاصة لإجراء الفحوصات والملاحظات من ردود الفعل السريرية في الحيوانات العادية. هناك حاجة إلى القتل الرحيم المبكرة بنسبة CO ₂ الاستنشاق إذا لم حالة الحيوان تفي بالمعايير الأخلاقية.
3. تعيين آلة التخدير.
   1. تأكد من أن الأنبوب متصلا بشكل صحيح وغير معطوب بأي شكل من الأشكال. تأكد من أن منطقة جيدة التهوية يعمل بشكل صحيح. قم بتوصيل مرشح رئيسي في زجاجة الأيزوفلورين وملء vaporizer مع كمية كافية من الأيزوفلورين.
   2. فتح امدادات الغاز (الهواء والأكسجين) وتأكد من أن زجاجات تحتوي على ما يكفي من الغاز للتجربة. موصل ثلاثي ومن ثم قادرا على إرسال تدفق الأيزوفلورين إلى غرفة تحريض أو قناع.
4. بدوره ثلاثية في الموصل لغرفة تحريض. اختيار الماوس واحد من قفص المنزل وادخال الحيوان في الغرفة. ضبط منظم التدفق إلى 1.0 L الأوكسجين / دقيقة و 1.0 L / الهواء دقيقة. ضبط تركيز الأيزوفلورين إلى 4-5٪.
5. عند الوصول إلى المستوى المطلوب من التخدير، وعند الوصول إلى المستوى المطلوب من التخدير، حلق المنطقة الجراحية ونقل الحيوان من غرفة إلى قناع. بدوره ثلاثية في الموصل لتدفق قناع. ضبط منظم التدفق إلى 0.25 L الأوكسجين / دقيقة و 0.25 L / الهواء دقيقة.
   1. ضبط تركيز الأيزوفلورين إلى 1،5-2،5٪. فحص مستوى التخدير عن طريق التحكم عن رد الفعل ومعدل التنفس قبل البدء في الاجراء الجراحيه.
6. إصلاح الساقين من الماوس لمقاعد البدلاء العمل باستخدام شريط لاصق. تأكد من أن الأنف من الحيوان ما زال ضعه بعناية في القناع.

3. الجراحة وتحفيز عصب فاجوس

1. تطهير المنطقة الجراحية مع 70٪ من الإيثانول.
2. باستخدام مشرط، شق بعناية الجلد على مستوى الرقبة (شق حوالي 1-1،5 سم).
   ملاحظة: في البروتوكول، وإجراء عملية جراحية ينتهي هنا للحيوانات التي تديرها SHAM. وبالفعل، فقد تبين أن مجرد لمس العصب بأداة معدنية تحفز بالفعل إلى حد ما. لذلك، للحصول على السيطرة جراحة أكثر دقة الحيوان عند استخدام كمية صغيرة من LPS، ووقف عملية جراحية في هذه الخطوة.
3. بمساعدة المجهر (الهدف 12.5X)، عزل العصب المبهم الأيسر من الشريان السباتي باستخدام ملقط تشريح. تحديد أول عضلة القصية الترقوية الخشائية عن طريق إزالة الجلد والدهون طبقات، ومن ثم التراجع عن ذلك فيأجل وضع ملقط وراء كل من العصب والشريان.
   ملاحظة: الخطوة التالية هي صعبة للغاية، كما يتم الالتزام العصب والشريان بشكل وثيق مع بعضها البعض. ولذلك، فمن السهل جدا لقطع السفينة وقتل الحيوان. ومع ذلك، من خلال وضع ملقط بعناية فائقة بين العصب والشريان، فهي تفصل في نهاية المطاف، وأنه من الممكن لعزل العصب.
4. وضع القطب (الشكل 1B) تحت العصب المبهم. القطب إبرة طويلة جدا، لذلك حتى لو كان يتحرك العصب طفيفا خلال التحفيز، وسوف تكون دائما على اتصال مع القطب.
5. إجراء حقن داخل الصفاق (IP) من LPS (2 ملغ / كغ) مع مساعدة من حقنة (لللقراءة من على مستويات خلوى، أي لقياس تأثير تنظيم لأسفل).
6. انتظر 5 دقائق قبل بدء التحفيز.
7. تحفيز العصب المبهم لمدة 5 دقائق في 5 V و 1 هرتز من خلال الضغط على زر البدء في برنامج الاعتراف.
8. إعادةنقل القطب وخياطة الجرح من الحيوان مع خيوط الجروح الجراحية.
9. رش لا ستينغ الحاجز فيلم (NSBF) على الجرح من أجل تحسين الشفاء وللحماية من العدوى.

4. استرداد الحيوان

1. بعد الجراحة، ونقل الحيوانات إلى قفص وطنه للصحوة والانتعاش. تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء من أجل الحفاظ على درجة حرارة الجسم، تأكد من مراقبة الحيوانات حتى يتم استعاد وعيه الكامل.
2. السماح للحيوان التعافي في قفصه ل6 ساعات قبل التضحية من أجل التحليل.
   ملاحظة: تأثير تحفيز العصب المبهم هو سريع جدا وكما أظهرت أن تكون طويلة الأمد (تصل إلى 48 ساعة)، وبالتالي فإن الوقت الانتعاش يمكن وضعها عن طريق المجرب وفقا لاحتياجات الدراسة.

5. التضحية لمزيد من التحليل

1. وضع الحيوانات في قفص ترتبط إلى جهاز إدارة CO _2.
2. ضبط الجهاز على 5دورة -min من CO ₂ الاستنشاق.
3. عندما يتم القتل الرحيم، وجمع أجهزة الفائدة وتجميد مباشرة لهم على الثلج الجاف لمزيد من التحليل (على سبيل المثال، وقياس مستويات خلوى في مقتطفات الطحال باستخدام الماوس TH1 / فحص TH2 9 بلكس) ^3.

النتائج

مستوى TNFα وانترلوكين 1β (IL-1β) بعد زيادة الفاصل الزمني بعد الجراحة وتقليل جرعة من LPS

كما هو موضح سابقا، وذلك باستخدام بروتوكول الأصلي، وانخفاض VNS مستويات TNFα (169.3 ± 24.9 جزء من الغرام / ملغ في SHAM مقابل 39....

Discussion

منذ اكتشافه في وقت مبكر 2000s، آليات CAP تم دراسة وافية. لدينا الآن صورة جيدة عن الطريق، وعلى وجه الخصوص، الجهاز المستهدف، والطحال، حيث NE، خلايا الذاكرة T، منظمة العمل ضد الجوع، والضامة العمل كفريق واحد فعال جدا إلى أسفل تنظيم وسطاء التهابات ^2. ونحن أيضا نشرت ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden