Augmentation du temps de récupération et une diminution de LPS administration à étudier les mécanismes de stimulation du nerf vague dans les réponses inflammatoires limitées

Résumé

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Résumé

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Introduction

L'immunité innée fournit une première ligne de défense immédiate contre les infections et les maladies dans un large éventail d'organismes. Elle initie non seulement la réponse immunitaire primaire pour éliminer la menace, mais il joue également un rôle central dans l'activation et l'éducation de l'immunité adaptative qui réalise des réponses immunitaires secondaires d'une manière spécifique des agents pathogènes. L'inflammation est orchestrée par une pléthore de cytokines et chimiokines, qui à leur tour ont la capacité d'attirer d'autres cellules immunitaires sur le site d'infection et d'induire les signes cardinaux de l'inflammation, tels que la rougeur, l'enflure, la douleur, la perte de la fonction et de la fièvre . La durée et l'intensité de l'inflammation dépendent de plusieurs facteurs, mais la résolution de l'inflammation et la restauration de l'homéostasie est une étape essentielle pour éviter l'apparition de maladies inflammatoires chroniques. Les progrès récents dans le domaine des neurosciences et de l'immunologie ont élucidé les mécanismes neuronaux spécifiques avec un immense potentiel thérapeutique pour contrôler inflinflammation à la fois dans le système nerveux central et à la périphérie. L' un de ces mécanismes est la voie anti-inflammatoire cholinergique (CAP), également connu sous le réflexe inflammatoire, qui est entraîné par le système nerveux autonome ^{4, 5.}

On pense actuellement que les médiateurs inflammatoires activent les nerfs sensoriels et envoient des signaux sur l'état de l'inflammation au système nerveux central. Une réponse réflexe est ensuite activé par l'intermédiaire du nerf efférent pneumogastrique. Une étude approfondie des détails anatomiques de la PAC a mis en évidence un modèle parasympathique-sympathique composé de deux nerfs, le nerf vague et les nerfs splénique, respectivement ^6. Dans le CAP, le nerf cholinergique vagal efférente activé se termine dans le ganglion mésentérique-cœliaque, ce qui entraîne l'activation du nerf adrénergiques splénique par un mécanisme encore à explorer. Le nerf splénique, ainsi activé, est connu pour intérieurevée à proximité des cellules immunitaires dans la pulpe blanche, la zone marginale et la pulpe rouge de la rate, le principal organe et obligatoire de la PAC ^{7, 8.} Norépinéphrine (NE) à partir des terminaisons nerveuses spléniques se lie aux récepteurs β ₂ adrénergiques correspondantes exprimées sur les lymphocytes T spléniques. Ceci induit la libération choline acétyltransférase (ChAT) médiée par l' acétylcholine (ACh), qui à son tour active les récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine a7 (α7nACh) sur les macrophages, ce qui limite la production et l' inflammation cytokine ^2. Par conséquent, il est maintenant clair que le système nerveux est capable de réguler l'inflammation dans les tissus périphériques et de rétablir l'homéostasie immunitaire locale.

Comme le nom de la voie indique, le système acétylcholine est d'une importance capitale pour le bon fonctionnement de cette voie de régulation neuro-immunitaire. Fait intéressant, les mécanismes impliqués dans l'activation desla PAC semble être différente dans la périphérie et dans le système nerveux central. Bien que l'importance des récepteurs nicotiniques (α7nAChR) dans la rate a été démontré plus haut ^9, les récepteurs muscariniques (mAChR) sont obligatoires pour l'activation de la voie centrale ^{10, 11.} Plus récemment, l' administration périphérique d'un facteur de nécrose tumorale sériques et de la rate agoniste muscarinique M1 à action centrale sensiblement supprimée α (TNF) au cours de l' endotoxémie létale murine, une action requise nerf vague intact et le nerf splénique de signalisation ^12. Nous avons également montré récemment que les souris dépourvues prostaglandine E ₂ (PGE ₂₎ ne sont pas en mesure de répondre à la stimulation du nerf vague et ne régulent la libération induite par le LPS de cytokines dans le sérum et la rate ^3. Par conséquent, la PAC pourrait également être réglementé par des systèmes autres que les principaux pathw Achay.

Le nerf vague a été nommé en tant que tel en raison de son parcours de déambulation dans le corps, innervant principaux organes , y compris le foie, les poumons, la rate, les reins et l' intestin ^13. Compte tenu de cette grande innervation et l'effet immunosuppresseur très puissant du nerf pneumogastrique, le potentiel thérapeutique de la PAC pourrait couvrir un large éventail de conditions inflammatoires. Le nerf vague peut être électriquement (ou mécanique) activé, avec contrôle de la tension et la fréquence, et contrairement aux traitements classiques, sans médicaments ajoutés au corps. Des essais sont en cours chez les patients rhumatismales, par exemple, pour tester la signification clinique de VNS dans le traitement de l' inflammation chronique ^14. Au total, la communication neuro-immunitaire et régulation de l'inflammation sont actuellement à l'étude, qui fournira un traitement alternative possible au traitement conventionnel. Par conséquent, l'analyse du nerf vague stimulationeffet n dans les différents organes innervé, mais aussi la caractérisation de l'action thérapeutique potentielle dans des modèles animaux d'inflammation chronique, serait certainement donner un aperçu et l'espoir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

La méthodologie originale développée par Tracey et ses collègues ⁴ ne pouvait pas être transposée à notre domaine de la recherche en raison de surstimulation de la réponse inflammatoire (par une dose létale de LPS) et une plage de temps trop court entre l' activation CAP et la lecture. Dans le présent document, nous allons présenter les modifications apportées au protocole d'origine, comparer les deux méthodes différentes sur les taux de cytokines, et mettre en évidence une nouvelle observation et à l'opposé de l'organe cible (la rate).

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux approuvés par le Comité local d'éthique à l'Institut Karolinska, Stockholm. Le Comité d'éthique local suit les directives de l'Union européenne sur les soins des animaux.

REMARQUE: Les principaux changements par rapport au protocole initial est le temps de récupération après la chirurgie (6 heures par rapport à 1 h) et le niveau de LPS injectées (2 mg / kg par rapport à 15 mg / kg). Dans le cas contraire, les différents paramètres liés à la chirurgie elle-même n'a pas été modifié.

1. Préparation du matériau pour la stimulation

1. Allumer l'ordinateur et le système d'acquisition de données relié à l'électrode de stimulation (figure 1A).
2. Entrez le Acquitter programme.
3. Préparer une solution mère de LPS à une concentration de 5 mg / ml dans 1 x PBS, aliquote, et stocker à -20 ° C. Le jour de l'expérience, dégeler une aliquote et préparer un adequate échantillon de LPS (0,5 mg / ml) afin d'injecter autour de 100 ul dans l'animal, en fonction du poids.

2. Préparation de l'animal pour l'anesthésie

1. Utilisation des souris C57BL / 6. Maintenir les conditions climatiques contrôlées avec une lumière de 12 heures / cycle d' obscurité, les nourrir pour rongeurs standard, et leur donner ad libitum de l' eau.
2. Effectuer la chirurgie sur des souris qui pèsent environ 25 g le jour de l'expérience.
   REMARQUE: Lorsque des réactions inflammatoires sont induites, il est particulièrement important d'effectuer des contrôles réguliers et observations des réactions cliniques chez les animaux. L' euthanasie prématurée par inhalation de CO ₂ est nécessaire si la condition animale ne répond pas aux critères éthiques.
3. Régler la machine anesthésique.
   1. Assurez-vous que le tube est correctement connecté et n'est pas endommagé de quelque façon. Assurez-vous que la zone aérée fonctionne correctement. Branchez le filtre clé à la bouteille isoflurane et remplir le vapoRizer avec une quantité suffisante d'isoflurane.
   2. Ouvrez l'alimentation en gaz (air et de l'oxygène) et assurez-vous que les bouteilles contiennent suffisamment de gaz pour l'expérience. Un connecteur à trois voies est alors en mesure d'envoyer le flux isoflurane à la chambre d'induction ou le masque.
4. Tourner le connecteur à trois voies à la chambre d'induction. Choisir une souris de la cage et introduire l'animal dans la chambre. Ajuster le régulateur de débit de 1,0 L / min d'oxygène et de 1,0 L / min d'air. Ajuster la concentration de l'isoflurane à 4-5%.
5. Lorsque le niveau souhaité de l'anesthésie est atteinte, lorsque le niveau souhaité de l'anesthésie est atteinte, raser la zone chirurgicale et déplacer l'animal de la chambre vers le masque. Tournez le connecteur à trois voies à l'écoulement du masque. Ajuster le régulateur de débit de 0,25 L / min d'oxygène et 0,25 L / min d'air.
   1. Ajuster la concentration en isoflurane à 1.5 à 2.5%. Vérifier le niveau de l'anesthésie par le contrôle réflexe et la fréquence respiratoire avant de commencer le procedur chirurgicale.
6. Fixer les pattes de la souris sur le banc de travail en utilisant du ruban adhésif. Assurez-vous que le nez de l'animal est toujours bien positionné dans le masque.

3. La chirurgie et la stimulation du nerf vague

1. Désinfecter la zone chirurgicale avec 70% d'éthanol.
2. L'utilisation d'un scalpel, inciser soigneusement la peau au niveau du cou (incision d'environ 1 à 1,5 cm).
   Remarque: Dans le protocole, la procédure de chirurgie se termine ici pour les animaux opérés de manière fictive. En effet, il a été démontré que juste toucher le nerf avec un outil métallique stimule déjà dans une certaine mesure. Par conséquent, pour obtenir un animal témoin de la chirurgie plus précise lors de l'utilisation d'une petite quantité de LPS, arrêter la chirurgie à cette étape.
3. Avec l'aide d'un microscope (objectif 12,5X), isoler le nerf vague gauche de l'artère carotide en utilisant une pince à disséquer. Tout d'abord localiser le muscle sterno en éliminant les couches de la peau et la graisse, puis se rétracter dansafin de mettre le forceps derrière les deux le nerf et l'artère.
   Remarque: L'étape suivante est très délicate, car le nerf et l' artère sont étroitement collées les unes aux autres. Par conséquent, il est très facile de couper le vaisseau et tuer l'animal. Cependant, en plaçant la pince très soigneusement entre le nerf et l'artère, ils se séparent finalement, et il est possible d'isoler le nerf.
4. Placer l'électrode (figure 1B) dans le cadre du nerf vague. L'électrode à aiguille est assez long, même si le nerf se déplace légèrement au cours de la stimulation, il sera toujours en contact avec l'électrode.
5. Effectuer une injection intraperitoneale (ip) de LPS (2 mg / kg) à l'aide d'une seringue (pour la lecture sur les taux de cytokines, à savoir, pour mesurer l'effet de la régulation à la baisse).
6. Attendre 5 minutes avant de commencer la stimulation.
7. Stimuler le nerf vague pendant 5 minutes à 5 V et 1 Hz en appuyant sur le bouton de démarrage dans l'acquittement programme.
8. Rédéplacer l'électrode et le fil de suture de la plaie de l'animal avec un fil de suture chirurgical.
9. Vaporisez une barrière Film Non Sting (NSBF) sur la plaie afin d'améliorer la guérison et à protéger contre les infections.

4. Récupération de l'animal

1. Après la chirurgie, déplacer l'animal à sa cage pour le réveil et la récupération. Sous la lumière infra-rouge afin de maintenir la température du corps, assurez-vous de surveiller l'animal jusqu'à la pleine conscience a été retrouvé.
2. Laissez l'animal récupérer dans sa cage pendant 6 heures avant le sacrifice pour l'analyse.
   Note: L'effet de la stimulation du nerf vague est très rapide et a également été démontré que de longue durée (jusqu'à 48 heures), de sorte que le temps de récupération peut être réglée par l'expérimentateur en fonction des besoins de l'étude.

5. Sacrifice aux fins d'analyse

1. Placer l'animal dans une cage reliée à un dispositif d'administration de CO _2.
2. Réglez l'appareil sur un 5Cycle -min d'inhalation de CO _2.
3. Lorsque l'euthanasie est fait, collecter les organes d'intérêt et les congeler directement sur de la glace sèche pour une analyse ultérieure (par exemple, la mesure des taux de cytokines dans les extraits de la rate en utilisant un TH1 de la souris / TH2 dosage 9-Plex) ^3.

Résultats

Niveau de TNFa et Interleukin-1β (IL-1β) après avoir augmenté le Accéléré après la chirurgie et la diminution de la dose de LPS

Comme montré précédemment, en utilisant le protocole d'origine, VNS a diminué les niveaux de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg dans SHAM par rapport à 39,7 ± 10,8 pg / mg dans VNS, p <0,001) et l'IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg de SHAM contre 191,7 ± 27,2 pg / mg dans VNS, p <0,01) ...

Discussion

Depuis sa découverte au début des années 2000, les mécanismes de la PAC ont été soigneusement étudiés. Nous avons maintenant une bonne image de la voie, et en particulier, l'organe cible, la rate, où NE, les cellules T mémoire, Ach et macrophages travail en équipe très efficace pour réguler négativement les médiateurs inflammatoires ^2. Nous avons récemment publié des données sur l'importance d'un système de prostaglandine fonctionnelle chez les souris, en particulie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden