增加了恢复时间，并减少LPS管理研究迷走神经刺激机制的有限炎症反应

摘要

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

摘要

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

引言

先天免疫提供了针对感染和疾病在广泛的生物体防御的立即第一行。它不仅启动初次免疫应答以消除威胁，但它也起着活化和教育，其执行在病原体特异性方式二次免疫应答的适应性免疫中起关键作用。炎症细胞因子和趋化因子过多，这反过来又吸引其他免疫细胞对感染部位的能力和诱发炎症的主要体征，如红，肿，痛，功能丧失，发热策划。的持续时间和炎症的强度取决于几个因素，但解决炎症和恢复稳态是避免慢性炎症性疾病的发病的关键步骤。在神经科学和免疫学领域的最新进展没有完全揭开特定的神经机制，与巨大的治疗潜能控制INFL无论是在中枢神经系统和外周ammation。一这些机制之一是胆碱能抗炎通路（CAP），也被称为炎性反射，这是由自主神经系统^4,5驱动。

这是目前认为炎症介质激活感觉神经和发送有关炎症的状态，以中枢神经系统的信号。一种反射反应，然后通过传出迷走神经活性。在CAP的解剖细节进行了广泛的研究揭示了两个神经组成的副交感神经，交感神经模型，迷走神经和神经脾，分别为^6。在CAP中，活化胆碱能传出迷走神经在腹腔 - 肠系膜神经节结束，导致肾上腺素能神经脾的活化的机制尚待探索。脾神经，从而激活，已知的是内瓦泰岛接近免疫细胞在白色的纸浆，边缘区，和脾，主要和强制器官CAP ^7,8的红髓。去甲肾上腺素（NE）从脾神经末梢结合于脾T淋巴细胞上表达相应的_β2肾上腺素能受体。这引起胆碱乙酰转移酶（ChAT的）介导的乙酰胆碱（ACh）的释放，这反过来又激活巨噬细胞上α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nACh），从而限制了细胞因子的产生和炎症^2。因此，现在很清楚，神经系统能够调节炎症外周组织和恢复局部免疫稳态。

由于通路顾名思义，乙酰胆碱系统是至关重要的这种神经免疫调节通路的功能。有趣的是，在所涉及的激活的机制的CAP似乎是在周边和在中枢神经系统中的不同。而烟碱受体（α7nAChR）在脾的重要性在前面已经证明^9，毒蕈碱受体（的mAChR）是强制性的通路^10，11的中心活化。最近，一个中枢作用M1毒蕈碱激动剂的外周施用显著抑制血清和脾脏肿瘤坏死因子α（TNFα）致死小鼠内毒素血症期间，所要求的完整迷走神经，脾神经信令¹²的动作。最近，我们还表明，缺乏前列腺素E ₂小鼠（PGE _2）无法对迷走神经刺激作出反应，并没有下调血清和脾脏³中的细胞因子的LPS诱导释放。因此，CAP也可能比主乙酰胆碱pathw其他系统调节唉。

迷走神经已被命名为这样的，因为其在体内游荡当然，支配主要器官，包括肝，肺，脾，肾和肠^13。考虑到这个大神经支配和迷走神经的非常有效的免疫效果，CAP的治疗潜力可以覆盖广泛的炎症性疾病。迷走神经可电（或机械）活化，具有过电压和频率，并与传统的治疗控制，无药物加入到所述主体。试验目前在风湿病患者进行，例如，以测试在治疗慢性炎症¹⁴ VNS的临床意义。总之，神经·免疫通信和炎症的调节目前正在研究中，这将提供一个可能的替代治疗对常规治疗。因此，迷走神经的分析stimulatio在不同的神经支配的器官n效果，同时也表征在慢性炎症的动物模型中的潜在治疗作用的，肯定会给予的见解，并希望新的潜在治疗靶点。

由特蕾西和他的同事⁴开发的原始方法不能移位，我们的研究领域，由于炎症反应（由LPS的致死剂量）的过度刺激和CAP激活和读出之间太短的时间范围。在本论文中，我们将提出对原始协议所做的修改，对细胞因子水平比较两个不同的方法，并突出于靶器官（脾）的新和相反观察。

研究方案

所有的动物实验均根据照顾和使用由当地伦理委员会Karolinska研究所，斯德哥尔摩批准动物的指导进行。当地伦理委员会如下动物保健的欧盟指令。

注意:从原始协议的主要变化是恢复时间后手术（6小时对 1小时）和LPS的水平注射（2mg / kg的与 15毫克/千克）。否则，与手术本身不同的设置没有被改变。

1.准备材料刺激

1. 打开计算机和连接到刺激电极（ 图1A）中的数据采集系统上。
2. 进入应答程序。
3. 以5毫克/毫升在1×PBS中，等分它制备浓度LPS的储备溶液，并且将其存储在-20℃。在实验的当天，解冻等分并准备ADE为了根据重量至约100微升注入到动物，LPS（0.5毫克/毫升）的样品quate。

2.准备麻醉动物

1. 使用C57BL / 6小鼠。保持它们与12小时亮/暗循环的气候受控条件下，喂它们标准啮齿动物食物，并给予他们随意饮水 。
2. 对周围25克打压实验当天小鼠进行手术。
   注:当炎症反应引起的，它进行定期检查，并在动物临床反应的观察就显得尤为重要。如果动物条件不满足道德标准需要通过CO ₂吸入过早安乐死。
3. 设置麻醉机。
   1. 确保油管连接是否正确，并以任何方式不被损坏。确保通风正常工作。关键过滤器连接到异氟醚瓶，并填补了VAPOrizer用异氟烷的足够量。
   2. 打开气源（空气和氧气），并确保该瓶含有足够的天然气用于实验。三通连接器，然后能够将异氟醚流发送到所述吸气室或掩模。
4. 打开三路连接器的感应室。匹克从家笼一个鼠标和插入动物进入室内。调节流量调节器，以1.0升/分钟的氧气和1.0升/分钟的空气。调节异氟烷浓度为4 - 5％。
5. 当达到麻醉的期望的水平，当达到麻醉的期望电平，剃手术区和从所述腔室到所述掩模移动的动物。打开三路连接到面罩流。调节流量调节器，以0.25升/分钟的氧气和0.25升/分钟的空气。
   1. 调节异氟烷浓度至1.5 - 2.5％。在开始手术再修改前检查通过神经反射控制和呼吸速率麻醉水平即
6. 修复鼠标使用胶带工作台的腿。确保动物的鼻子还在仔细位于掩模。

迷走神经的3外科和刺激

1. 消毒用70％乙醇手术区。
2. 使用手术刀，仔细在颈部（约1至1.5厘米的切口）的电平切开皮肤。
   注:在该协议中，手术过程结束这里假手术的动物。事实上，这已经表明，刚刚接触到神经用金属工具已经能够刺激到一定程度。因此，使用LPS少量时获得更准确的手术控制动物，停止在这一步的手术。
3. 用显微镜（12.5X物镜）的帮助下，从隔离使用解剖镊颈动脉左侧迷走神经。首先通过去除皮肤和脂肪层定位胸锁乳突肌，然后收回它为了把镊子神经和动脉都落后。
   注:以下步骤是非常棘手的，因为神经和动脉贴紧对方。因此，这是很容易切断血管，杀死动物。但是，通过将镊子非常仔细的神经和动脉之间，他们最终分开，并有可能对神经隔离。
4. 放置电极（ 图1B）的迷走神经下。针状电极是很长，所以即使神经刺激过程中轻微移动，它总是会在与电极接触。
5. （关于细胞因子水平对所读出的， 即，为了测量下调效应）进行LPS的腹膜内（ip）注射（2毫克/千克）与注射器的帮助。
6. 在开始刺激前等待5分钟。
7. 通过在确认程序按下启动按钮刺激5分钟的迷走神经在5V和1Hz。
8. 回覆移动电极和缝合手术缝合线的动物的伤口。
9. 喷在伤口无刺阻隔薄膜（NSBF），以提高治疗和感染保护。

4.动物的恢复

1. 手术后，将动物返回其家笼觉醒和恢复。在为了保持体温的红外光，确保监测动物，直到全意识已经恢复。
2. 让动物在笼子里收回牺牲分析前6小时。
   注:迷走神经刺激的效果是非常快，也被证明是持久（可达48小时），所以恢复时间可以由实验者根据研究的需要进行设置。

5.牺牲作进一步的分析

1. 放置动物在链接到一个CO ₂管理装置的保持架。
2. 在设备上设置一个5CO ₂吸入-min周期。
3. 当安乐死完成后，收集感兴趣的器官，并直接将它们冷冻用于进一步的分析干冰（ 例如，细胞因子水平的中脾提取物使用鼠标TH1测量/ TH2 9-Plex的测定^）3。

结果

手术后增加时间流逝和减少LPS的剂量后TNFα和白介素1β（IL-1β）的水平

如前所示，使用原来的协议，VNS降低TNFα的水平（169.3±24.9皮克/在SHAM mg相比在VNS 39.7±10.8皮克/毫克，P <0.001）和IL-1β（360.0±40.21微克/毫克SHAM对191.7±27.2皮克/在VNS腹膜内注射LPS（15毫克/千克）（ 图2A）以后毫克，p <0.01）在脾。改变用于分析的时...

讨论

自21世纪初发现的，盖的机制已经被彻底研究。我们现在有途径的好照片，特别是，靶器官，脾，其中NE，记忆性T细胞，乙酰胆碱，和巨噬细胞作为一种非常有效的团队工作，下调炎症介质^2。我们最近还发表了关于功能性前列腺素系统的小鼠中的重要性，特别是PGE _2，这显然是对乙酰胆碱的释放脾脏中盖³的活化后的强制性成分数据。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden