복구 시간 증가 및 제한 염증 반응에서 미주 신경 자극 메커니즘을 연구에 LPS 관리를 감소

요약

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

초록

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

서문

선천성 면역은 유기체의 넓은 범위에서 감염과 질병에 대한 방어의 즉각적인 첫 번째 라인을 제공합니다. 그것은 위협을 제거하기 위해 차 면역 반응을 시작 할뿐 아니라 활성화하고 병원균 고유의 방식으로 차 면역 반응을 수행하는 후천성 면역 교육에 중추적 인 역할을한다. 염증은 다시 감염 부위에 다른 면역 세포를 유치 할 수있는 능력을 가지고 같은 발적, 부종, 통증, 기능의 손실 및 발열과 같은 염증의 추기경 표지판을 유도하는 사이토 카인과 케모카인의 과다에 의해 조율한다 . 기간과 염증의 강도는 여러 가지 요인에 따라 달라집니다,하지만 염증을 해결하고 항상성을 회복하는 만성 염증성 질환의 발병을 방지하기 위해 중요한 단계입니다. 신경 과학 및 면역학 분야의 최근 발전 infl을 제어하는 ​​엄청난 치료 가능성과 특정 신경 메커니즘을 풀어 한중추 신경계 및 주변의 ammation. 이들 메커니즘 중 하나는 자율 신경계 ^{(4, 5)에} 의해 구동되는 염증성 반사적으로 알려진 콜린성 소염 통로 (CAP)이다.

현재 염증 매개체는 중추 신경계 염증의 상태에 관한 신호를 감각 신경을 활성화하고 전송할 것으로 생각된다. 반사 응답은 원심성 미주 신경을 통해 작동된다. 캡의 해부학 적 세부 사항에 대한 광범위한 연구는 두 개의 신경으로 구성 부교감 - 교감 모델, 미주 신경 및 비장 신경 각각 ^6을 공개했다. 카프에서 활성화 콜린성 원심성 미주 신경은 아직 탐구하는기구에 의해 비장 아드레날린 신경의 활성화의 결과로, 복강 신경절-장간막에서 끝난다. 따라서 활성화 된 비장 신경, 내측으로 알려져흰색 펄프의 면역 세포에 근접, 한계 영역 및 CAP ^{(7), (8)의} 비장, 원금과 필수 기관의 빨간 펄프에서 되어진. 비장 신경 말단에서 노르 에피네프린 (NE)의 비장 T 림프구상에서 발현 해당 β ₂ 아드레날린 수용체에 결합한다. 이것은 차례로함으로써 사이토 카인 생성 및 ^{염증이 제한} 식세포 α7 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (α7nACh)를 활성화 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (하는 ChAT) - 매개 성 아세틸 콜린 (ACH) 방출을 유도한다. 결과적으로, 신경계는 말초 조직에 염증을 조절하는 지역 면역 항상성을 복원 할 수 있는지 지금은 분명하다.

통로의 이름에서 알 수 있듯이, 아세틸 콜린 시스템이 신경 면역 조절 경로의 기능에 중앙 중요하다. 흥미롭게도, 메커니즘의 활성화에 관여캡 주변부 및 중추 신경계에서 다른 것처럼 보인다. 비장의 니코틴 수용체의 중요성 (α7nAChR)가 이전 ⁹ 입증되었지만, 무스 카린 수용체 (mAChR)는 경로 ^{(10), (11)의} 중앙 활성화를위한 필수입니다. 치명적인 뮤린 패혈증 동안 최근 중앙에 작용하는 M1 무스 카린 성 작용제의 말초 투여가 현저히 억제 혈청 비장 종양 괴사 인자 α (TNFα), ^{(12) 신호} 그대로 미주 신경 및 신경 비장 필요한 액션. 우리는 또한 프로스타글란딘 _{E이 결핍} 된 마우스 (PGE ₂₎ 미주 신경 자극에 응답 할 수 없었다 혈청과 비장 ³ 사이토 카인의 LPS 유도 방출을 다운 조절하지 않았다는 것을 최근에 보여 주었다. 따라서 CAP은 주요 아세틸 콜린의 pathw 이외의 다른 시스템에 의해 규제 될 수있다찬성.

미주 신경 때문에 체내에서의 방황 물론 같은 지명되었다, 간, 폐, 비장, 신장 및 창자 ^(13)를 포함한 주요 기관을 지배하는. 이 큰 신경 분포 및 미주 신경의 매우 강력한 면역 억제 효과를 고려하여, 캡의 치료 가능성은 염증 상태의 넓은 범위를 커버 할 수있다. 어떤 약물은 신체에 추가되지으로 미주 신경은 전기적 (또는 기계적) 통상적 인 처리의 전압 및 주파수와 반대로 제어하여, 활성화 될 수있다. 시험은 만성 염증 ^{(14) 치료에} VNS의 임상 적 의의를 테스트하기 위해, 예를 들어, 류마티스 환자에서 현재 진행되고 있습니다. 전부, 신경 - 면역 통신 및 염증의 조절은 기존의 치료에 대한 가능한 대안 치료를 제공 할 것이다 조사 중이다. 따라서, 미주 신경의 분석 stimulation 개의 서로 다른 분포하는 장기 효과하지만 만성 염증의 동물 모델에서 잠재적 인 치료 행동의도 특성은, 확실히 통찰력을 제공하고 새로운 잠재적 인 치료 목표에 대한 희망 것이다.

트레이시 동료 ^(4)에 의해 개발 된 기존 방법 때문에 (LPS의 치사량) 염증 반응의 자극을 넘어선 및 CAP 활성화 및 판독 사이에 너무 짧은 시간 범위에 조사 우리 필드 전치 수 없었다. 본 논문에서는, 원래의 프로토콜에 대한 변경을 제시한다 사이토킨 수준의 두 가지 방법을 비교하여 표적 기관 (비장)에 대향하는 새로운 관찰을 강조.

프로토콜

모든 동물 실험은 관리 및 카롤린스카 연구소, 스톡홀름에서 현지 윤리위원회의 승인을 동물의 사용 지침에 따라 수행 하였다. 지역 윤리위원회는 동물 보호에 관한 유럽 연합 지침을 따른다.

주 : 수술 (6 시간 내지 1 대) 및 LPS의 레벨 (15 밀리그램 / kg 대 2 밀리그램 / kg)를 주입 한 후 원래의 프로토콜에서의 주요 변화는 복구 시간이다. 그렇지 않으면, 수술 자체에 관련된 다른 설정이 변경되지 않았습니다.

1. 자극에 대한 자료를 준비

1. 컴퓨터와 자극 전극 (도 1A)에 연결된 데이터 수집 시스템 켜기.
2. 인정 인 프로그램을 시작합니다.
3. 5 밀리그램 / 1X PBS에 mL를 분취하여 농도의 LPS의 스톡 용액을 준비하고 -20 ℃에서 보관. 실험의 날, 나누어지는을 해동하고 에이드를 준비중량에 따라, 동물에 약 100 μL를 주입하기 위해 LPS (0.5 ㎎ / ㎖)의 quate 샘플.

2. 마취에 대한 동물 준비

1. C57BL / 6 마우스를 사용합니다. , 12 시간 빛 / 어둠주기와 기후의 조건을 유지 그들에게 표준 설치류 식사를 공급하고, 그들에게 임의 량의 물을 제공합니다.
2. 실험의 날에 약 25g 무게 쥐에 수술을 수행합니다.
   참고 : 염증 반응이 유발되는 경우,이 정기 검진과 동물 임상 반응의 관찰을 수행하는 것이 특히 중요하다. 동물의 조건이 윤리적 기준을 충족하지 않는 경우 CO ₂ 흡입 조기 안락사가 필요합니다.
3. 마취 기계를 설정합니다.
   1. 튜브가 제대로 연결되어 있고 손상되지 않았는지 확인합니다. 통풍 영역이 제대로 작동하는지 확인합니다. 이소 플루 란 병에 키 필터를 연결하고 VAPO을 채우기이소 플루 란 충분한 양 rizer.
   2. 가스 공급 (공기와 산소)를 열고 병 실험에 대한 충분한 가스를 포함하고 있는지 확인하십시오. 삼원 커넥터는 유도 챔버 또는 마스크에 이소 플루 란 흐름을 전송할 수있다.
4. 유도 챔버에 삼원 커넥터를 돌립니다. 홈 케이지에서 하나의 마우스를 선택하고 챔버로 동물을 삽입합니다. 1.0 L / 분의 산소 및 1.0 L / 분으로 공기 유동 조절기를 조정. 5 % - 4로 이소 플루 란 농도를 조정합니다.
5. 마취의 원하는 레벨에 도달하면, 마취 원하는 레벨에 도달하면, 외과 영역을 면도하고, 마스크 챔버로부터 동물을 이동. 마스크 흐름에 세 방향 커넥터를 돌립니다. 0.25 L / 분의 산소 및 0.25 L / 분으로 공기 유동 조절기를 조정.
   1. 2.5 % - 1.5로 이소 플루 란 농도를 조정합니다. 수술 procedur을 시작하기 전에 반사 제어 및 호흡에 의한 마취의 수준을 확인이자형.
6. 접착 테이프를 사용하여 작업 벤치에 마우스의 다리를 고정합니다. 동물의 코는 여전히 신중하게 마스크에 위치되어 있는지 확인합니다.

미주 신경 3. 수술 및 자극

1. 70 % 에탄올로 수술 영역을 소독.
2. 메스를 사용하여 조심스럽게 목 (약 1 ~ 1.5 cm의 절개)의 수준에서 피부를 절개.
   참고 : 프로토콜에서, 수술 절차가 SHAM-운영하는 동물 여기를 종료합니다. 사실, 단지 금속 도구 신경을 터치하면 이미 어느 정도를 촉진하는 것이 밝혀졌다. LPS의 소량을 사용하는 경우 따라서,보다 정확한 수술 제어 동물을 얻기 위해,이 단계에서 수술을 중지합니다.
3. 현미경 (12.5X 목적)의 도움으로, 해부 집게를 사용 경동맥에서 좌측 미주 신경을 분리. 먼저 피부와 지방이 층을 제거하여 흉쇄 근육을 찾은 다음에 그것을 철회신경과 동맥 모두 뒤에 집게를 넣어 주문.
   주 : 신경과 혈관이 서로 밀접하게 부착되어, 상기 다음 공정이 매우 까다 롭다. 따라서, 선박을 절감하고 동물을 죽이는 것은 매우 쉽습니다. 그러나, 신경 및 동맥 사이에 매우 신중하게 집게를 배치하여, 그들은 결국 분리, 그리고 신경을 분리하는 것이 가능하다.
4. 미주 신경 아래의 전극 (도 1b)를 놓는다. 바늘 전극은 매우 긴, 그래서 신경이 자극 동안 약간 이동하더라도, 그것은 항상 전극과 접촉 할 것이다.
5. (사이토 카인 수준에 대한 판독을위한, 즉, 하향 조절 효과를 측정하기 위해) 주사기의 도움 LPS의 복강 내 (IP) 주입 (2 밀리그램 / kg)을 수행한다.
6. 자극을 시작하기 전에 5 분을 기다립니다.
7. 인정 인 프로그램의 시작 버튼을 눌러 5 V 및 1 Hz에서 5 분 동안 미주 신경을 자극한다.
8. 레전극을 이동 외과 용 봉합 실을 가진 동물의 상처 봉합.
9. 순서 치유를 개선하고 감염으로부터 보호하기에 상처에 없음 스팅 배리어 필름 (NSBF)를 스프레이.

동물의 4. 복구

1. 수술 후, 각성 및 복구를 위해 다시 집 케이지에 동물을 이동합니다. 체온을 유지하기 위해 적외선 빛에 따라, 전체 의식이 회복 될 때까지 동물을 모니터링해야합니다.
2. 동물이 분석을 위해 희생하기 전에 6 시간 동안 새장에 복구 할 수 있습니다.
   주 : 미주 신경 자극의 효과는 매우 고속이고 또한 (48 시간까지) 지속되는 긴 것으로 도시되어 있으므로 복구 시간은 연구의 필요에 따라 실험에 의해 설정 될 수있다.

추가 분석을 위해 희생 5.

1. 공동 ₂ 관리 장치에 연결된 장에 동물을 놓는다.
2. 5에서 장치를 설정CO ₂ 흡입라는 우수한 성능을 나타내었다주기.
3. 안락사가 완료되면, 관심의 장기를 수집하고 직접 추가 분석을 위해 드라이 아이스에 그들을 동결 (예를 들어, 마우스 TH1을 사용하여 비장 추출물에서 사이토 카인 수준의 측정 / TH2 9 플렉스 분석) ^3.

결과

TNFα 및 인터루킨-1β (IL-1β)의 수준 LPS의 용량을 수술 후 시간 경과 증가 및 감소 후

이전에 나타낸 바와 같이, 원래의 프로토콜을 사용 VNS는 TNFα의 수준 및 IL-1β (360.0 ± 40.21 PG / 밀리그램 (39.7 ± 10.8 PG / VNS에서 ㎎, p <0.001 대 SHAM에서 169.3 ± 24.9 PG / ㎎) 감소 LPS를 복강 내 주사 (15 ㎎ / ㎏) (도 2A) 후의 비장 VNS에서 191.7...

토론

2000 년대 초반의 발견 이후, CAP의 메커니즘을 철저하게 연구되고있다. 우리는 지금 경로의 좋은 사진을 가지고 있고, 특히, 대상 기관, 비장, 매우 효율적인 팀으로 NE, 메모리 T 세포, 이크, 대 식세포 작업은 염증 매개 ² 다운 조절하는 곳. 우리는 또한 최근에 분명히 CAP ^3의 활성화 후 비장에서 아세틸 콜린의 방출을위한 필수 구성 요소, 특히 마우스의 기능 프로...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden