Erhöhte Erholzeit und abnehmend LPS-Verabreichung die Vagusnervstimulation Mechanisms in beschränkten Entzündungsreaktionen zu studieren

Zusammenfassung

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Zusammenfassung

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Einleitung

Angeborene Immunität sorgt für eine sofortige erste Verteidigungslinie gegen Infektionen und Krankheiten in einem breiten Spektrum von Organismen. Es initiiert nicht nur die primäre Immunantwort die Gefahr zu beseitigen, aber es spielt auch eine zentrale Rolle bei der Aktivierung und die adaptive Immunität zu erziehen, die in einer pathogen-spezifischen Weise sekundäre Immunantworten führen. Die Entzündung wird durch eine Vielzahl von Zytokinen und Chemokinen orchestriert, was wiederum die Fähigkeit haben, andere Immunzellen an den Ort der Infektion zu gewinnen und die kardinalen Zeichen einer Entzündung, wie Rötung, Schwellung, Schmerzen, Verlust der Funktion und Fieber zu induzieren . Die Dauer und die Intensität der Entzündung, hängen von mehreren Faktoren ab, aber die Entzündung zu lösen und die Wiederherstellung der Homöostase ist ein wichtiger Schritt, um die Entstehung von chronischen entzündlichen Erkrankungen zu vermeiden. Jüngste Fortschritte auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und Immunologie haben spezifische neuronale Mechanismen mit immensem therapeutischem Potential entwirren Einfl zu steuernammation sowohl im zentralen Nervensystem und in der Peripherie. Einer dieser Mechanismen ist der cholinerge antiinflammatorische Stoffwechselweg (CAP), das auch als Entzündungs reflex bekannt, die durch das autonome Nervensystem ^{4, 5} angesteuert wird.

Es wird derzeit angenommen, dass Entzündungsmediator sensorische Nerven aktivieren und den Zustand der Entzündung auf das zentrale Nervensystem über Signale senden. Ein Reflexantwort wird dann durch die efferente Vagusnerv aktiviert. Eine umfangreiche Studie über die anatomischen Details der Kappe hat ein Parasympathikus-sympathisches Modell zweiere Nerven, den Vagusnerv und splenic Nerven bzw. ⁶ zusammengesetzt offenbart. In der Kappe endet die efferente cholinerge aktivierten Vagusnerv im celiac-mesenterialen Ganglion, was zur Aktivierung des adrenergen Nerven splenic durch einen Mechanismus noch erforscht werden. Die Milz- Nerven-, so aktiviert wird, um innere bekanntvate in unmittelbarer Nähe zu Immunzellen in der weißen Pulpa, Randzone, und roten Pulpa der Milz, der Haupt- und obligatorischen Organ der Kappe ^{7, 8.} Norepinephrin (NE) aus dem Nervenendigungen splenic bindet an den β ₂ -adrenergen Rezeptoren auf Milz - T - Lymphozyten exprimiert entspricht. Dies induziert Cholin - Acetyltransferase (ChAT) -vermittelten Acetylcholin (ACh) -Freisetzung, die wiederum α7 nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (α7nACh) auf Makrophagen aktiviert, wodurch die Begrenzung der Cytokinproduktion und Entzündungen ^2. Folglich ist es nun klar, dass das Nervensystem in der Lage ist eine Entzündung in den peripheren Geweben zu regulieren und lokale Immunhomöostase wiederherzustellen.

Wie der Name des Weges schon sagt, ist das ACh-System von zentraler Bedeutung für das Funktionieren dieses neuro-immun regulierenden Weges. Interessanterweise beteiligten Mechanismen bei der Aktivierung vondie CAP scheint unterschiedlich in der Peripherie und im Zentralnervensystem zu sein. Während die Bedeutung von nikotinischen Rezeptoren (α7nAChR) in der Milz hat früher ⁹ gezeigt worden sind Muscarin - Rezeptoren (mAChR) zwingend für die zentrale Aktivierung des Weges ^{10, 11.} In jüngerer Zeit, Muscarin periphere Verabreichung eines zentral wirkenden M1 - Agonisten signifikant unterdrückt Serum und Milz Tumornekrosefaktor α (TNF & agr;) während lethal murine Endotoxämie, eine Aktion , die intakte Vagusnerv und splenic Nervensignale ¹² erforderlich. Wir haben auch vor kurzem , dass Mäuse ohne Prostaglandin E ₂ (PGE ₂₎ waren nicht in der Lage zu reagieren Vagusnervstimulation und nicht herunterregulieren die LPS-induzierte Freisetzung von Zytokinen im Serum und Milz ³ gezeigt. Daher könnte die GAP auch von anderen Systemen als dem Haupt ACh pathw geregelt werdenay.

Der Vagusnerv hat als solche wegen seiner Wanderung natürlich im Körper, Innervation Hauptorgane einschließlich der Leber, Lunge, Milz, Nieren und Darm ¹³ benannt. diese große Innervation und die sehr starke immunsuppressive Wirkung des Nervus vagus In Anbetracht könnte das therapeutische Potenzial der GAP eine Vielzahl von entzündlichen Erkrankungen abdecken. Der Nervus vagus kann elektrisch (oder mechanisch) aktiviert wird, die Kontrolle über die Spannung und die Frequenz, und im Gegensatz zur konventionellen Behandlung, ohne Arzneimittel auf den Körper gegeben. Studien laufen derzeit bei Rheumapatienten, zum Beispiel, die klinische Bedeutung der VNS zu testen , in ¹⁴ chronische Entzündung zu behandeln. Insgesamt ist die Neuroimmun-Kommunikation und Regulation der Entzündung derzeit untersucht, die eine mögliche alternative Behandlung zur konventionellen Therapie bieten. Daher Analyse des Nervus vagus stimulation-Effekt in den verschiedenen Organen innerviert, sondern auch die Charakterisierung der potentiellen therapeutischen Wirkung in Tiermodellen der chronischen Entzündung, würde auf jeden Fall Einblicke geben und für neue potenzielle therapeutische Ziele hoffen.

Die ursprüngliche Methode , entwickelt von Tracey und Kollegen ⁴ konnte wegen Reizüberflutung der entzündlichen Reaktion auf unseren Bereich der Forschung umgesetzt werden (durch eine letale Dosis von LPS) und einem zu kurzem Zeitbereich zwischen CAP - Aktivierung und dem Auslesen. In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir die auf den ursprünglichen Protokoll vorgenommene Änderungen, vergleichen die beiden unterschiedlichen Methoden auf Cytokinspiegel, und markieren Sie eine neue und entgegengesetzte Beobachtung auf dem Zielorgan (Milz).

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren von der lokalen Ethikkommission am Karolinska Institutet, Stockholm genehmigt durchgeführt. Die lokale Ethikkommission folgt den Richtlinien der Europäischen Union auf die Tierpflege.

HINWEIS: Die wesentlichen Änderungen aus dem ursprünglichen Protokoll sind die Erholungszeit nach der Operation (6 h gegenüber 1 h) , und die Höhe der LPS injizierten (2 mg / kg im Vergleich zu 15 mg / kg). Andernfalls sich nicht geändert worden sind, die verschiedenen Einstellungen der Operation zusammen.

1. Vorbereiten Werkstoff für Stimulation

1. Schalten Sie den Computer und dem Datenerfassungssystem zu der Stimulationselektrode (1A) verbunden ist .
2. Geben Sie das Quittieren Programm.
3. Vorbereiten einer Stammlösung von LPS in einer Konzentration von 5 mg / ml in 1X PBS, Aliquot es und lagern bei -20 ° C. Am Tag des Experiments, tauen eine aliquote und bereitet eine adeQuate Probe von LPS (0,5 mg / ml), um etwa 100 & mgr; l in das Tier zu injizieren, nach dem Gewicht.

2. Vorbereitung des Tier für Anästhesie

1. Verwenden Sie C57Bl / 6-Mäuse. Pflegen sie unter klimatisierten Bedingungen mit einer 12-Stunden - Hell / Dunkel - Zyklus, füttern sie Standard - Nagetierfutter, und geben ihnen Wasser ad libitum.
2. Führen Sie Operation auf Mäuse, die etwa 25 g am Tag des Experiments wiegen.
   HINWEIS: Bei Entzündungsreaktionen hervorgerufen werden, ist es besonders wichtig regelmäßige Vorsorgeuntersuchungen und Beobachtungen der klinischen Reaktionen bei den Tieren durchzuführen. Eine vorzeitige Euthanasie durch CO ₂ Inhalation erforderlich ist , wenn der Zustand eines Tieres nicht die ethischen Kriterien nicht erfüllt.
3. Stellen Sie das Anästhesiegerät.
   1. Achten Sie darauf, dass der Schlauch richtig angeschlossen ist und nicht in irgendeiner Weise beschädigt. Achten Sie darauf, dass die belüfteten Bereich richtig funktioniert. Schließen Sie den Schlüssel Filter auf die Flasche Isofluran und füllen das vaporizer mit einer ausreichenden Menge von Isofluran.
   2. Öffnen Sie die Gaszufuhr (Luft und Sauerstoff) und stellen Sie sicher, dass die Flaschen genug Gas für das Experiment enthalten. Ein Drei-Wege-Verbinder kann dann die Isofluran Strömung zur Induktionskammer oder die Maske zu senden.
4. Drehen Sie den Drei-Wege-Anschluss mit dem Induktionskammer. Wählen Sie eine Maus aus dem Käfig und setzen Sie das Tier in die Kammer. Stellen Sie den Durchflußmengenregler auf 1,0 l / min Sauerstoff und 1,0 l / min Luft. Stellen Sie die Isofluran-Konzentration auf 4 bis 5%.
5. Wenn der gewünschte Grad der Anästhesie erreicht ist, wenn der gewünschte Grad der Anästhesie erreicht ist, schert das Operationsgebiet und das Tier aus der Kammer zu der Maske bewegen. Drehen Sie den Drei-Wege-Anschluss an die Maske fließen. Stellen Sie den Durchflußmengenregler auf 0,25 l / min Sauerstoff und 0,25 L / min Luft.
   1. Stellen Sie die Isofluran-Konzentration auf 1,5 bis 2,5%. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie durch Reflex-Steuerung und Atemfrequenz vor der chirurgischen procedur Ausgangse.
6. Fix die Beine der Maus auf die Werkbank Klebeband. Achten Sie darauf, dass die Nase des Tieres noch sorgfältig in der Maske positioniert ist.

3. Operation und Stimulation des Nervus vagus

1. Desinfizieren das Operationsgebiet mit 70% Ethanol.
2. Unter Verwendung eines Skalpells, einzuschneiden sorgfältig die Haut auf der Höhe des Halses (Inzision von etwa 1 bis 1,5 cm).
   Hinweis: Im Protokoll endet die Chirurgie Verfahren hier für Sham-Tiere. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass nur mit einem Metallwerkzeug den Nerv berührt es bereits zu einem gewissen Grad stimuliert. Daher ein genaueres Operation Kontrolltier zu erhalten, wenn eine kleine Menge an LPS mit, bei diesem Schritt die Operation stoppen.
3. Mit Hilfe eines Mikroskops (12,5-fach-Objektiv), Isolieren des linken Vagusnerv aus der Arteria carotis mittels Dissektionszangen. Zuerst suchen Sie die Kopfnickers von Haut und Fettschichten zu entfernen und zurückziehen sie dann inbestellen die Zange setzen hinter sowohl den Nerv und die Arterie.
   Anmerkung: Der folgende Schritt sehr schwierig ist, da die Nerven und Arterie eng aneinander geklebt sind. Daher ist es sehr einfach, das Schiff und tötet das Tier zu schneiden. Doch durch die Zange sehr sorgfältig zwischen Nerv und Arterie platziert, sie schließlich zu trennen, und es ist möglich, den Nerv zu isolieren.
4. Die Elektrode (1B) , unter dem Vagusnerv. Die Nadelelektrode ist ziemlich lang, so dass selbst wenn der Nerv leicht während der Stimulation bewegt, wird es immer mit der Elektrode in Kontakt sein.
5. Führen Sie eine intraperitoneale (ip) Injektion von LPS (2 mg / kg) mit Hilfe einer Spritze (für das Auslesen auf Cytokinspiegel, dh die nach unten regulierenden Wirkung zu messen).
6. Warten 5 min vor Beginn der Stimulation.
7. Stimulieren des Vagusnervs für 5 min bei 5 V und 1 Hz durch die Starttaste in dem Programm Acknowledge drücken.
8. Rebewegen, um die Elektrode und die Wunde vernäht des Tieres mit chirurgischen Nähfadens.
9. Sprühen Sie einen No Sting Barrier Film (NSBF) auf der Wunde, um die Heilung zu verbessern und vor Infektionen zu schützen.

4. Wiederherstellung des Tieres

1. Nach der Operation bewegt in seinen Heimkäfig das Tier zurück zum Erwachen und Erholung. Unter Infrarot-Licht, um die Körpertemperatur zu halten, stellen Sie sicher, dass das Tier zu überwachen, bis volles Bewusstsein wiedererlangt hat worden.
2. Lassen Sie das Tier für 6 Stunden vor der Tötung zur Analyse in seinem Käfig erholen.
   Hinweis: Die Wirkung der Vagusnervstimulation ist sehr schnell und hat auch durch den Experimentator festgelegt wird entsprechend die Bedürfnisse der Studie gezeigt wurde , kann seine lang anhaltende (bis zu 48 h), so dass die Recovery - Zeit.

5. Opfer für die weitere Analyse

1. Legen Sie das Tier in einem an eine CO ₂ Verabreichungsvorrichtung verbunden Käfig.
2. Stellen Sie das Gerät auf eine 5-min Zyklus von CO ₂ Inhalation.
3. Wenn die Euthanasie durchgeführt wird, die Organe von Interesse sammeln und sie direkt für die weitere Analyse auf Trockeneis einfrieren (zB die Messung von Cytokinspiegel in Milz Extrakten eine Maus TH1 / TH2 9-Plex - Test unter Verwendung) ^3.

Ergebnisse

Level von TNFa und Interleukin-1β (IL-1β) nach dem Zeitraffer nach der Operation Erhöhung und Verringerung der Dosis von LPS

Wie vorher gezeigt, kann das ursprüngliche Protokoll verwenden, verringert VNS die Niveaus von TNF & agr; (169,3 ± 24,9 pg / mg in SHAM gegenüber 39,7 ± 10,8 pg / mg in VNS, p <0,001) und IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg in SHAM gegenüber 191,7 ± 27,2 pg / mg in VNS, p <0,01) in der Milz na...

Diskussion

Seit seiner Entdeckung in den frühen 2000er Jahren wurden die Mechanismen der GAP gründlich untersucht. Wir haben jetzt ein gutes Bild des Weges, und insbesondere das Zielorgan, die Milz, wo NE, Gedächtnis - T - Zellen, Ach, und Makrophagen Arbeit als ein sehr effizientes Team herunterregulieren Entzündungsmediator ^2. Wir haben vor kurzem auch Daten über die Bedeutung eines funktionellen Prostaglandinsystems bei Mäusen veröffentlicht, insbesondere PGE _2, die für die ACh - Freis...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden