Увеличение времени восстановления и снижение LPS администрации по изучению Нерв стимуляции блуждающего механизмов в ограниченной Воспалительные Ответы

Резюме

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Аннотация

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Введение

Врожденный иммунитет обеспечивает немедленную первую линию защиты против инфекций и заболеваний в широком диапазоне организмов. Она не только инициирует первичный иммунный ответ, чтобы устранить угрозу, но оно также играет ключевую роль в активации и обучение адаптивного иммунитета, который выполняет вторичные иммунные ответы в патоген-специфическим образом. Воспаление оркестровщик- множеством цитокинов и хемокинов, которые, в свою очередь, имеют возможность привлекать другие иммунные клетки к очагу инфекции и вызвать кардинальные признаки воспаления, такие как покраснение, отек, боль, потеря функции и лихорадка , Продолжительность и интенсивность воспаления зависят от нескольких факторов, но разрешение воспаления и восстановление гомеостаза является важным шагом, чтобы избежать возникновения хронических воспалительных заболеваний. Последние достижения в области неврологии и иммунологии разгадали конкретные механизмы нейронные с огромным терапевтическим потенциалом для контроля Влиянammation как в центральной нервной системе и на периферии. Одним из таких механизмов является холинергический противовоспалительный путь (САР), также известный как воспалительный рефлекс, который приводится в действие вегетативной нервной системы ^{4, 5.}

В настоящее время считается, что воспалительные медиаторы активировать сенсорные нервы и посылают сигналы относительно состояния воспаления в центральной нервной системе. Рефлекс ответ затем активируется через эфферентный блуждающий нерв. Обширное исследование на анатомических деталях CAP выявило парасимпатическую-симпатическую модель , состоящую из двух нервов, блуждающий нерв и селезеночной нерв, соответственно ^6. В CAP, активированный холинергический эфферентный блуждающий нерв заканчивается в глютеновом-брыжеечных ганглии, что приводит к активации адренергического селезеночного нерва с помощью механизма, еще предстоит исследовать. Селезеночный нерв, таким образом, активируется, как известен, внутренниеVate в непосредственной близости от иммунных клеток в белой пульпе, краевой зоне и красной пульпе селезенки, основные и обязательного орган CAP ^{7, 8.} Норэпинефрина (NE) из селезеночных нервных окончаний связывается с соответствующими β ₂ адренергических рецепторов , экспрессируемых на селезеночных Т - лимфоцитов. Это вызывает холина ацетил трансферазы (ХАТ) -опосредованного ацетилхолин (АХ) релиз, который , в свою очередь , активирует А7 никотиновые рецепторы ацетилхолина (α7nACh) на макрофагах, тем самым ограничивая продукцию цитокинов и воспаление ^2. Следовательно, теперь ясно, что нервная система способна регулировать воспаление в периферических тканях и восстановления местного иммунного гомеостаза.

Как видно из названия пути предполагает, система АЧ имеет решающее значение для функционирования этого нейро-иммунных регулировочного пути. Интересно отметить, что механизмы, участвующие в активацииПСП, кажется, отличаются по периферии и в центральной нервной системе. В то время как значение никотиновых рецепторов (α7nAChR) в селезенке было показано ранее , ^9, мускариновые рецепторы (mAChR) являются обязательными для центральной активации пути ^{10, 11.} Совсем недавно, периферическое введение центрально-действующих М1 мускаринового агониста значительно подавленные сыворотки и опухоль селезенки фактор некроза α (TNF & alpha ; ) в течение летальной мышиной эндотоксемии, действие , которое требуется интактный блуждающий нерв и селезеночной нерв сигнализации ^12. Мы также показали , что в последнее время мыши , лишенные простагландина Е ₂ (PGE ₂₎ не были способны реагировать на блуждающего нерва и не вниз регулировать LPS-индуцированное высвобождение цитокинов в сыворотке крови и селезенки ^3. Таким образом, CAP также может регулироваться, кроме основного АХ pathw системау.

Блуждающий нерв был назван так потому , что его блуждающий конечно в организме, иннервирующих основные органы , включая печень, легкие, селезенку, почки и кишечник ^13. Учитывая эту большую иннервацию и очень мощного иммунодепрессивное действие блуждающего нерва, терапевтический потенциал CAP может охватывать широкий спектр воспалительных состояний. Блуждающий нерв может быть электрический (или механически) активируется, с контролем над напряжением и частотой, и наоборот к обычному лечению, с никаких наркотиков не было добавлены к телу. Испытания в настоящее время проводятся в ревматических больных, например, чтобы проверить клиническую значимость ВНС при лечении хронического воспаления ^14. В целом, нейро-иммунной связи и регуляция воспаления в настоящее время под следствием, что обеспечит возможную альтернативную обработку к обычной терапии. Поэтому анализ блуждающего нерва stimulatioп эффект в различных иннервируемых органах, но и характеристика потенциального терапевтического действия в животных моделей хронического воспаления, несомненно, даст понимание и надеется на новые потенциальных терапевтических целях.

Оригинальная методика , разработанная Tracey и его ^{коллегами-не} может быть перенесена на поле нашего исследования из - за перевозбуждения воспалительного ответа (летальной дозой LPS) и слишком короткий интервал времени между активацией CAP и считыванием. В данной работе, мы представим изменения, сделанные к первоначальному протоколу, сравнить две различные методологии на уровнях цитокин, а также выделить новое и противоположное наблюдение на целевом органе (селезенка).

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию животных, утвержденных местного комитет по этике при Каролинском институте, Стокгольм. Комитет по этике местным следует директиве Европейского союза по уходу за животными.

Примечание: Основные изменения от первоначального протокола является время восстановления после операции (6 ч по сравнению с 1 ч) , а уровень LPS инъекции (2 мг / кг по сравнению с 15 мг / кг). В противном случае, различные параметры, относящиеся к самой операции не были изменены.

1. Подготовка Материал для стимуляции

1. Включите компьютер и систему сбора данных , связанную с стимулирующим электродом (фиг.1А).
2. Введите подтверждени программу.
3. Подготовка исходного раствора LPS в концентрации 5 мг / мл в PBS, 1x аликвоты его, и хранить его при температуре -20 ° C. В день эксперимента, оттаивать аликвоты и подготовить ADEQuate образец LPS (0,5 мг / мл) для того, чтобы впрыскивать около 100 мкл в организм животного, в зависимости от веса.

2. Подготовка животных для производства анестезиологии

1. Используйте C57BL / 6. Поддерживать их под климат-контролем условиях с 12-ч цикле свет / темнота, кормить их стандартный корм для грызунов, и дать им воды вволю.
2. Выполните операцию на мышах, которые весят около 25 г в день эксперимента.
   Примечание: Когда воспалительные реакции индуцируется, это особенно важно проводить регулярные осмотры и наблюдения клинических реакций у животных. Преждевременная эвтаназия путем ингаляции СО ₂ необходимо , если условие животного не соответствует этическим критериям.
3. Установите обезболивающую машину.
   1. Убедитесь, что трубка правильно подключен и не поврежден каким-либо образом. Убедитесь в том, что хорошо вентилируемом помещении работает должным образом. Подключите ключ фильтр к изофлурановой бутылке и заполнить VAPORizer с достаточным количеством изофлурана.
   2. Откройте подачу газа (воздух и кислород) и убедитесь в том, что бутылки содержат достаточное количество газа для эксперимента. Трехходовой разъем затем может отправить изофлуран поток в индукционной камере или маски.
4. Поверните разъем трехходовой к индукции камеры. Выберите одну мышь из домашней клетки и вставить животное в камеру. Настройка регулятора потока до 1,0 л / мин кислорода и 1,0 л / мин воздуха. Регулировка концентрации изофлурана до 4 - 5%.
5. Когда желаемый уровень анестезии достигается, когда желаемый уровень анестезии достигается, брить хирургическую область и переместить животное из камеры к маске. Поверните разъем трехходовой к потоку маски. Настройка регулятора потока до 0,25 л / мин кислорода и 0,25 л / мин воздуха.
   1. Регулировка концентрации изофлурана до 1,5 - 2,5%. Проверьте уровень анестезии рефлекторного контроля и частоты дыхания до начала хирургического procedurе.
6. Закрепить ножки мыши к рабочему столу с помощью клейкой ленты. Убедитесь, что нос животного до сих пор бережно расположен в маске.

3. Хирургия и стимуляция блуждающего нерва

1. Лечить хирургическую область с 70% -ным этанолом.
2. Используя скальпель, осторожно надрезать кожу на уровне шеи (разрез около 1 до 1,5 см).
   Примечание: В протоколе, процедура операции заканчивается здесь ложнооперированными животных. Действительно, было показано, что только касаясь нерва с металлическим инструментом уже стимулирует его в какой-то степени. Поэтому, чтобы получить более точный контроль хирургии животных при использовании небольшого количества LPS, остановить операцию на этом этапе.
3. С помощью микроскопа (12.5x объективном), изолировать левый блуждающий нерв от сонной артерии с помощью рассекает щипцов. Сначала найдите кивательной мышцы путем удаления кожи и жировых отложений, а затем убрать его втого, чтобы положить пинцетом за оба нерва и артерии.
   Примечание: Следующий шаг очень сложно, так как нервы и артерии тесно привязаны друг к другу. Таким образом, очень легко разрезать судно и убить животное. Тем не менее, очень осторожно поместив щипцы между нервом и артерией, они в конечном счете по отдельности, а можно изолировать нерв.
4. Поместите электрод (Фигура 1В) под блуждающим нервом. Игольчатый электрод достаточно длинный, так что даже если нерв слегка перемещается во время стимуляции, он всегда будет находиться в контакте с электродом.
5. Выполните внутрибрюшинного (IP) инъекцию LPS (2 мг / кг) с помощью шприца (для считывания на уровни цитокинов, то есть, чтобы измерить вниз для регулирования эффекта).
6. Подождите, за 5 мин до начала стимуляции.
7. Стимулирует блуждающий нерв в течение 5 мин при 5 В и 1 Гц, нажав на кнопку запуска в программе Acknowledge.
8. реперемещать электрод и сшивать рану животного с хирургической шовной нитью.
9. Спрей Нет Sting барьерной пленки (NSBF) на рану с целью улучшения заживления и защиты от инфекций.

4. Восстановление животных

1. После операции перемещения животных обратно в клетку для пробуждения и восстановления. Под инфракрасного света для того, чтобы поддерживать температуру тела, убедитесь, чтобы контролировать животное до полного сознания не было восстановила.
2. Пусть животное восстановить в своей клетке в течение 6 ч до умерщвления для анализа.
   Примечание: Влияние блуждающего нерва происходит очень быстро , и также было показано, что длительный (до 48 часов), таким образом, время восстановления может быть установлено экспериментатором в соответствии с потребностями исследования.

5. Жертвоприношение для дальнейшего анализа

1. Поместите животное в клетку , связанную с устройством управления СО _2.
2. Установите устройство на 5-min цикл СО ₂ ингаляции.
3. Когда эвтаназии будет сделано, собирают органы , представляющие интерес , и заморозить их непосредственно на сухом льду для дальнейшего анализа (например, измерение уровней цитокинов в селезенке экстрактов с помощью мыши TH1 / TH2 9-Plex анализ) ^3.

Результаты

Уровень ФНО и интерлейкина-1 (IL-1) после того, как увеличение промежутка времени после хирургии и снижения дозы LPS

Как было показано ранее, используя оригинальный протокол, ВНС снизились уровни TNF & alpha; (169,3 ± 24,9 пг / мг в ложной операции пр?...

Обсуждение

С момента своего открытия в начале 2000-х годов, механизмы ПСП были тщательно изучены. Теперь у нас есть хорошее представление о пути, и в частности, орган - мишень, селезенку, где СВ, память Т - клетки, ACH и макрофаги работают как очень эффективная команда , чтобы подавлять воспалительные мед...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden