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要約

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

要約

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

概要

先天性免疫は、生物の広い範囲の感染および疾患に対する防御の即時の最初のラインを提供します。それは脅威を排除するための一次免疫応答を開始するだけでなく、それはまた、病原体特異的に二次免疫応答を行い、適応免疫を活性化し、教育において重要な役割を果たしています。炎症は順番に感染部位に他の免疫細胞を誘引する能力を持っていると、このような赤み、腫れ、痛み、機能の喪失、および発熱などの炎症の基本的兆候を誘導するサイトカインおよびケモカインの過多によって画策されました。期間や炎症の強さは、いくつかの要因に依存するが、炎症を解決し、恒常性を回復することは慢性炎症性疾患の発症を回避するための重要なステップです。神経科学および免疫学の分野における最近の進歩はINFLを制御するために巨大な治療的可能性を持つ特定の神経機構を解明してきました中枢神経系における及び末梢の両方でammation。これらのメカニズムのいずれかはまた、自律神経系4、5により駆動される炎症性の反射として知られているコリン作動性抗炎症経路(CAP)、です。

現在、炎症性メディエーターは、感覚神経を活性化し、中枢神経系に炎症の状態に関するシグナルを送ることを考えています。反射反応は、その後、遠心性迷走神経を介して活性化されます。 CAPの解剖学的詳細について鋭意研究がそれぞれ二つの神経、迷走神経および脾臓神経、6からなる副交感神経、交感神経モデルを明らかにしました。 CAPにおいて、活性化されたコリン作動性遠心性迷走神経は、まだ探求される機構によってアドレナリン脾臓神経の活性化をもたらす、セリアック病、腸間膜神経節で終わります。このようにして活性化脾臓神経は、内側にはよく知られています白色パルプ、マージナルゾーン、および脾臓の赤脾髄、CAP 7,8の主及び必須の器官における免疫細胞に近接しvate。脾臓神経終末からのノルエピネフリン(NE)は、脾臓Tリンパ球上に発現される、対応するβ2アドレナリン受容体に結合します。これは、今度は、それによりサイトカイン産生および炎症2を限定マクロファージ上のα7ニコチン性アセチルコリン受容体(α7nACh)を、活性化コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)媒介性アセチルコリン(ACH)放出を誘導します。したがって、神経系は、末梢組織に炎症を調節すると、局所免疫恒常性を復元することが可能であることが明らかです。

経路の名前が示すように、AChのシステムでは、この神経免疫調節経路の機能に中心的な重要性です。興味深いことに、メカニズムは、の活性化に関与しますCAPは、周囲の中枢神経系で異なるように見えます。脾臓中のニコチン性受容体(α7nAChR)の重要性は以前9が実証されてきたが、ムスカリン受容体(のmAChR)は経路10、11の中心活性のために必須です。致死マウス内毒素血症時より最近、中枢作用性M1ムスカリン性アゴニストの末梢投与が有意に抑制血清および脾臓腫瘍壊死因子α(TNFα)、12シグナリング無傷の迷走神経及び脾臓神経を必要なアクション。我々はまた、プロスタグランジンE 2(PGE 2)を欠損したマウスは、迷走神経刺激に応答し、血清および脾臓3におけるサイトカインのLPS誘導性の解放をダウンレギュレートしませんでしたができなかったことが最近示されています。したがって、CAPは、メインアセチルコリンpathw以外のシステムにより調節されるかもしれませんAY。

迷走神経は、理由は体内での放浪もちろん、肝臓、肺、脾臓、腎臓、および腸13を含む主要臓器を支配などの名前が挙がっています。この大規模な神経支配と迷走神経の非常に強力な免疫抑制効果を考慮すると、CAPの治療可能性は、炎症状態の広い範囲をカバーできます。迷走神経は、体に加えない薬剤と、電気的に(または機械的に)活性化され、電圧および周波数の制御と、従来の治療法とは逆であってもよいです。試験は、慢性炎症14を治療する際のVNSの臨床的意義をテストするために、例えば、リウマチ患者では、現在進行中です。要するに、炎症の神経免疫通信および調節は、従来の治療に対する可能な代替治療を提供しており、現在調査中です。そのため、迷走神経の分析stimulation個の異なる神経支配器官における効果が、慢性炎症の動物モデルでの潜在的な治療行為のも特徴づけは、間違いなく洞察を与え、新しい潜在的な治療標的のために望んでいるだろう。

トレイシーと同僚4によって開発されたオリジナルの方法論が原因(LPSの致死量によって)炎症反応の過剰刺激とCAPの活性化と読み出しの間にあまりにも短い時間帯に研究の私たちのフィールドに置き換えることができませんでした。本論文では、我々は、元のプロトコルに対する変更を提示サイトカインレベル上の2つの異なる方法を比較し、標的臓器(脾臓)に新しい反対観察を強調表示します。

プロトコル

全ての動物実験は、カロリンスカ研究所、ストックホルムで地元の倫理委員会によって承認された動物の管理と使用のためのガイドラインに従って行いました。地元の倫理委員会は、動物のケアに関する欧州連合指令に従っています。

注:元のプロトコルからの主な変更点は、手術後の回復時間(1時間 6時間)であり、LPSのレベルを(15ミリグラム/ kgの 2mg / kgの)を注入しました。それ以外の場合は、手術自体に関連するさまざまな設定が変更されていません。

1.刺激のための材料を準備

  1. コンピュータ及び刺激電極( 図1A)に連結されたデータ収集システムをオン。
  2. アクノリッジプログラムを入力します。
  3. 1×PBS中5mg / mlの濃度のLPSのストック溶液を調製し、アリコートにし、-20℃で保管します。実験の日に、アリコートを解凍し、ADEを準備重量に応じて、動物に約100μLを注入するために、LPSのquateサンプル(0.5 mg / mlと)。

2.麻酔のための動物の準備

  1. C57BL / 6マウスを使用してください。 、12時間の明/暗サイクルで気候制御された条件下でそれらを維持し、それらを標準的なげっ歯類固形飼料を供給し、それらに水を自由に与えます。
  2. 実験の日に、周りに25グラムの重量を量るマウスに手術を行います。
    注:炎症反応が誘導されると、動物での臨床反応の定期検診や観察を行うことが特に重要です。動物の条件は倫理的な基準を満たしていない場合はCO 2吸入による早期の安楽死が必要とされています。
  3. 麻酔マシンを設定します。
    1. チューブが正しく接続されており、どのような方法で破損していないことを確認します。換気が正常に動作していることを確認してください。イソフルランボトルにキーフィルタを接続し、VAPOを埋めますイソフルランの十分な量とrizer。
    2. ガス供給(空気や酸素)を開き、ボトルは、実験のために十分なガスが含まれていることを確認してください。 3ウェイコネクタは、誘導室やマスクにイソフルランの流れを送信することができます。
  4. 誘導室に、三方コネクタを回します。ホームケージから1匹のマウスを選択し、チャンバー内に動物を挿入します。 1.0 L /分の酸素と1.0 L /分の空気を流量調整器を調整します。 5% - 4にイソフルラン濃度を調整します。
  5. 麻酔の所望のレベルに達したときに、麻酔の所望のレベルに達したとき、手術領域を剃るマスクにチャンバーから動物を移動させます。マスクの流れに、三方コネクタを回します。 0.25リットル/分の酸素および0.25リットル/分の空気を流量調整器を調整します。
    1. 2.5% - 1.5イソフルラン濃度を調整します。外科procedurを開始する前に、反射制御および呼吸数によって麻酔のレベルをチェックしてください電子。
  6. 粘着テープを使用した作業台にマウスの足を固定してください。動物の鼻はまだ慎重にマスク内に配置されていることを確認してください。

迷走神経の3手術と刺激

  1. 70%エタノールで手術領域を消毒します。
  2. メスを使用して、慎重に首(約1〜1.5センチの切開部)のレベルで皮膚を切開。
    注意:プロトコルでは、手術の手順は、偽手術動物のためにここで終了。確かに、それだけで金属製の工具で神経に触れることは、すでにある程度までそれを刺激することが示されています。したがって、LPSの少量を使用した場合、より正確な手術コントロール動物を取得するには、この段階で手術を停止します。
  3. 顕微鏡(12.5Xの目的)の助けを借りて、解剖ピンセットを用いて頸動脈から左迷走神経を分離します。まず皮膚や脂肪の層を除去することにより、胸鎖乳突筋を見つけて、それを撤回神経と動脈の両方の後ろに鉗子を置くため。
    注:神経および動脈が互いに密接に付着される次のステップは、非常に厄介です。したがって、血管を切断して、動物を殺すことは非常に簡単です。しかし、神経と動脈の間で非常に慎重にピンセットを置くことによって、彼らは最終的に分離し、神経を単離することが可能です。
  4. 迷走神経の下電極( 図1B)を置きます。針電極はかなり長いので、神経が刺激中に、わずかに移動しても、それは常に、電極と接触することになります。
  5. (サイトカインレベルに対する読み出しのために、 すなわち、ダウンレギュレーションの効果を測定するために)注射器の助けを借りて、LPSの腹腔内(ip)注射(2mg / kgの)を実行します。
  6. 刺激を開始する前に、5分待ってください。
  7. アクノリッジプログラムのスタートボタンを押して5 V及び1Hzで5分間、迷走神経を刺激します。
  8. 再電極を移動させ、手術用縫合糸を用いて動物の創傷を縫合。
  9. 治癒を向上させ、感染から保護するために傷口にはありませんスティングバリアフィルム(NSBF)をスプレーしてください。

動物の4.回復

  1. 手術後、目覚めと回復のために戻ってそのホームケージに動物を移動します。体温を維持するために、赤外光の下では、完全な意識が回復されるまで、動物を監視するようにしてください。
  2. 動物は、分析のために犠牲にする前に6時間、そのケージに回復しましょう。
    注意:迷走神経刺激の効果は非常に高速であり、また、(48時間まで)持続長いことが示されているので、回復時間は、研究のニーズに応じて、実験者によって設定することができます。

さらなる分析のための5サクリファイス

  1. CO 2投与装置にリンクされているケージに動物を置きます。
  2. 5上のデバイスを設定します。CO 2吸入の-minサイクル。
  3. 安楽死が行われると、関心のある器官を収集し、直接、さらなる分析( 例えば、マウスTH1 / TH2 9プレックスアッセイを用いて脾臓抽出物中のサイトカインレベルの測定)のためにドライアイス上でそれらを凍結3。

結果

手術後の経過時間を増加し、LPSの投与量を減少した後、TNFαおよびインターロイキン-1β(IL-1β)のレベル

先に示したように、元のプロトコルを使用して、VNSは、TNFαのレベルおよびIL-1β(360.0±40.21 PG / MGに(39.7±10.8 PG / VNSのMg、P <0.001対SHAMで169.3±24.9 PG / mg)を減少しました腹腔内LPS注射(15ミリグラム/ kg)を( 図2A?...

ディスカッション

2000年代初頭におけるその発見以来、CAPのメカニズムは、徹底的に研究されてきました。私たちは今、ダウンレギュ炎症性メディエーター2に経路の良い写真を持って、特に、標的臓器、脾臓、非常に効率的なチームとしてNE、メモリーT細胞、のAch、およびマクロファージの仕事。また、最近明らかにCAP 3の活性化後の脾臓におけるACh放出のための必須の成?...

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years' Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ComputerToshiba-Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition systemBiopac SystemsMP150WSW
Acknowledge softwareBiopac Systems
Mice C57Bl/6Charles River
Anesthetic machineSimtec Engineering
Medical oxygen bottleAGA107563
Medical air bottle AGA108639
Vetflurane (1,000 mg/g)Virbac137317
LPSSigma-AldrichL2630
SalineMerck Millipore1024060080
PBS 10xSigma-AldrichP5493Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)BD Plastipak303172
Needles 23 GKD-FINE9002840.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)Sigma-AldrichF4142
Dissecting scissorsSigma-AldrichZ265969
Surgical suture 4-0EthiconG667G
Euthanasia unitEuthanex SmartboxEA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film3M Health Care3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kitMesoScale DiscoveryK15013C-1
Stimulating electrode deviceBiopac SystemsSTIMSOC
Aesculap Isis shaverAgnthosGT420
R70Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden

参考文献

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