Aumento do tempo de recuperação e diminuição da Administração LPS para estudar o nervo vago Estimulação Mecanismos em respostas inflamatórias Limitada

Resumo

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Resumo

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Introdução

A imunidade inata fornece uma primeira linha imediato de defesa contra infecções e doenças em uma ampla gama de organismos. Não só inicia a resposta imunitária primária para eliminar a ameaça, mas que também desempenha um papel central na activação e educar a imunidade adaptativa, que leva a cabo as respostas imunitárias secundárias em uma maneira específica para o agente patogénico. A inflamação é orquestrado por uma variedade de citocinas e quimiocinas, que por sua vez tem a capacidade para atrair outras culas imunitias para o local da infecção e para induzir os sinais cardinais da inflamação, tais como vermelhidão, inchaço, dor, perda de função e febre . A duração e a intensidade da inflamação depender de vários factores, mas resolver a inflamação e restaurar a homeostase é um passo crítico para evitar o aparecimento de doenças inflamatórias crónicas. Os avanços recentes no campo da neurociência e imunologia ter desvendado mecanismos neurais específicos com imenso potencial terapêutico para controlar inflamação tanto no sistema nervoso central e na periferia. Um destes mecanismos é a via colinérgica anti-inflamatória (PAC), também conhecido como o reflexo inflamatória, que é conduzido pelo sistema nervoso autónomo ^{4, 5.}

está atualmente acredita-se que mediadores inflamatórios ativar nervos sensoriais e enviar sinais sobre o estado de inflamação no sistema nervoso central. Uma resposta reflexa é então activada através do nervo vago eferente. Um extenso estudo sobre os detalhes anatômicos da PAC revelou um modelo parassimpático-simpático composto por dois nervos, o nervo vago e nervo do baço, respectivamente ^6. No PAC, o nervo vago eferente colinérgica activado termina no gânglio celíaco-mesentérica, resultando na activação do nervo esplénica adrenérgicos por um mecanismo ainda a ser exploradas. O nervo esplénica, assim activado, é conhecido por internovate em estreita proximidade com as células imunitárias na polpa branca, da zona marginal, e polpa vermelha do baço, o órgão principal e obrigatório da tampa ^{7, 8.} Norepinefrina (NE) a partir das terminações nervosas esplénicas liga-se aos receptores adrenérgicos β ₂ correspondentes expressas em linfócitos T esplénicos. Isto induz a libertação de colina-acetil-transferase (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que por sua vez activa os receptores nicotínicos de acetilcolina (a7 α7nACh) em macrófagos, limitando assim a produção de citoquinas e inflamação ^2. Consequentemente, é agora claro que o sistema nervoso é capaz de regular a inflamação em tecidos periféricos e para restaurar a homeostase imune local.

Tal como o nome sugere da via, o sistema de ACh é de importância fundamental para o funcionamento desta via de regulação neuro-imunitário. Curiosamente, os mecanismos envolvidos na activação dePAC parecem ser diferentes na periferia e no sistema nervoso central. Embora a importância dos receptores nicotínicos (α7nAChR) no baço foi demonstrado anteriormente ^9, os receptores muscarínicos (mAChR) são obrigatórios para a activação central da via ^{10, 11.} Mais recentemente, a administração periférica de um agonista muscarico M1 de acção central significativamente suprimidos de soro e de tumor baço α factor de necrose (TNF) durante a endotoxemia letal de murino, uma acção que necessário nervo vago intacta e nervo esplénica de sinalização ^12. Também demonstramos recentemente que os ratinhos que carecem de prostaglandina E ₂ (PGE ₂₎ não foram capazes de responder à estimulação do nervo vago e não regular negativamente a libertação induzida por LPS de citocinas no soro e no baço ^3. Portanto, o PAC também pode ser regulada por outros que o principal Camin ACh sistemasay.

O nervo vago foi nomeado como tal por causa de seu curso errante no corpo, que inervam principais órgãos, incluindo o fígado, pulmão, baço, rins, intestino e ^13. Considerando esta grande inervação e o efeito imunossupressor muito potente do nervo vago, o potencial terapêutico da PAC podem abranger uma vasta gama de condições inflamatórias. O nervo vago pode ser electricamente (ou mecanicamente) activado, com controlo sobre a tensão e a frequência, e contrariamente ao tratamento convencional, com nenhuma droga adicionada ao corpo. Estão actualmente em curso ensaios em pacientes reumáticos, por exemplo, para testar a importância clínica da VNS no tratamento da inflamação crónica ^14. No total, a comunicação e regulação da inflamação neuro-imunitário estão actualmente sob investigação, a qual irá fornecer um tratamento alternativo possível para a terapia convencional. Portanto, a análise do nervo vago estimulaçãoefeito n nos diferentes órgãos inervados, mas também a caracterização do potencial de ação terapêutica em modelos animais de inflamação crônica, com certeza gostaria de dar perspectivas e esperança para novos potenciais alvos terapêuticos.

A metodologia original desenvolvido por Tracey e colegas ⁴ não poderia ser transposto para o nosso campo de pesquisa devido a superestimulação da resposta inflamatória (por uma dose letal de LPS) e um intervalo de tempo muito curto entre a activação PAC ea-out ler. No presente estudo, iremos apresentar as alterações feitas no protocolo original, comparar as duas metodologias diferentes sobre os níveis de citocinas, e realçar uma nova observação e oposta sobre o órgão alvo (do baço).

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Karolinska, de Estocolmo. O comitê de ética local segue as directivas da União Europeia sobre cuidados com animais.

NOTA: As principais alterações do protocolo original são o tempo de recuperação após a cirurgia (6 h versus 1 hr) e o nível de LPS injectada (2 mg / kg versus 15 mg / kg). Caso contrário, as diferentes definições relacionadas com a cirurgia em si não foram alteradas.

1. Preparar material para a estimulação

1. Ligue o computador e o sistema de aquisição de dados ligado ao eléctrodo de estimulação (figura 1A).
2. Entre no programa de reconhecer.
3. Prepara-se uma solução de reserva de LPS numa concentração de 5 mg / ml em 1x PBS, aliquota-lo, e armazená-lo a -20 ° C. No dia do experimento, descongelar uma alíquota e preparar um adequada amostra de LPS (0,5 mg / ml), a fim de injectar cerca de 100 ul no animal, de acordo com o peso.

2. Preparar o animal para a anestesia

1. Use ratinhos C57BL / 6. Mantê-los sob condições de temperatura controlada com uma luz de 12 h ciclo / escuro, alimentá-los comida normal para roedores, e dar-lhes água ad libitum.
2. Realizar a cirurgia em ratos que pesam cerca de 25 g no dia da experiência.
   Nota: Quando são induzidas reacções inflamatórias, que é particularmente importante para realizar exames regulares e observações das reacções clínicas nos animais. Eutanásia prematura por inalação de _CO2 é necessário se a condição animal não preenche os critérios éticos.
3. Configurar o aparelho anestésico.
   1. Certifique-se de que a tubulação está devidamente conectado e não está danificado de alguma forma. Certifique-se de que a área ventilada está funcionando corretamente. Conecte o filtro chave para a garrafa isoflurano e preencher a vaporizer com uma quantidade suficiente de isoflurano.
   2. Abra o suprimento de gás (ar e oxigênio) e certifique-se que as garrafas contêm gás suficiente para o experimento. Uma ligação de três vias é então capaz de enviar o fluxo de isoflurano para a câmara de indução ou a máscara.
4. Ligue o conector de tr vias para a câmara de indução. Escolher um rato a partir da gaiola de alojamento e inserir o animal para dentro da câmara. Ajustar o regulador de fluxo de 1,0 L / min de oxigénio e 1,0 L / min de ar. Ajustar a concentração de isoflurano a 4 - 5%.
5. Quando o nível desejado de anestesia é atingido, quando o nível desejado de anestesia é atingido, raspar a área cirúrgica e mover o animal a partir da câmara para a máscara. Ligue o conector de tr vias para o fluxo de máscara. Ajustar o regulador de fluxo de 0,25 L / min de oxigénio e de 0,25 L / min de ar.
   1. Ajustar a concentração de isoflurano para 1,5-2,5%. Verifique o nível de anestesia por controle reflexo e freqüência respiratória antes de iniciar o procedur cirúrgicae.
6. Fixar as pernas do mouse para a bancada de trabalho com fita adesiva. Certifique-se de que o nariz do animal ainda é cuidadosamente posicionada na máscara.

3. Cirurgia e estimulação do nervo vago

1. Desinfectar a área cirúrgica com 70% de etanol.
2. Utilizando um bisturi, com cuidado incisão na pele ao nível do gargalo (incisão de cerca de 1 a 1,5 cm).
   Nota: No protocolo, o procedimento de cirurgia termina aqui para animais operados ficticiamente. De fato, tem sido demonstrado que apenas tocando o nervo com uma ferramenta de metal já estimula-lo até certo ponto. Portanto, para obter um animal de controle cirurgia mais precisa quando se utiliza uma pequena quantidade de LPS, pare a cirurgia nesta etapa.
3. Com a ajuda de um microscópio (objectivo 12,5X), isolar o nervo vago esquerda a partir da artéria carótida utilizando um fórceps de dissecação. Primeiro localizar o esternocleidomastoideu através da remoção da pele e de gordura camadas, e, em seguida, retrai-la emfim de colocar a pinça para trás tanto o nervo ea artéria.
   Nota: O passo seguinte é muito complicado, como o nervo e artéria estão intimamente a aderir uns aos outros. Portanto, é muito fácil de cortar o navio e matar o animal. No entanto, colocando a pinça muito cuidadosamente entre o nervo e artéria, que, eventualmente, separar, e é possível isolar o nervo.
4. Colocar o eléctrodo (Figura 1B), sob o nervo vago. O elctrodo de agulha é bastante longo, por isso, mesmo se o nervo move-se ligeiramente durante a estimulação, que estará sempre em contacto com o eléctrodo.
5. Realizar uma injecção intraperitoneal (ip) de LPS (2 mg / kg) com a ajuda de uma seringa (para a leitura e para fora sobre os níveis de citocinas, ou seja, para medir o efeito de regulação para baixo).
6. Esperar 5 min antes do início da estimulação.
7. Estimular o nervo vago durante 5 min a 5 V e 1 Hz, empurrando o botão de arranque no programa Reconhecer.
8. Rémova o eletrodo e suturar o ferimento do animal com fio de sutura cirúrgica.
9. Spray de um Sem Sting Barreira Film (NSBF) sobre a ferida, a fim de melhorar a cicatrização e para proteger contra infecções.

4. Recuperação do animal

1. Após a cirurgia, mover o animal de volta para sua gaiola para despertar e de recuperação. Sob a luz infra-vermelha, a fim de manter a temperatura corporal, certifique-se de monitorar o animal até a plena consciência foi recuperada.
2. Deixe o animal recuperar em sua gaiola, durante 6 h antes de serem sacrificados para análise.
   Nota: O efeito da estimulação do nervo vago é muito rápida e tem também sido mostrado para ser de longa duração (até 48 horas), de modo que o tempo de recuperação pode ser definido pelo experimentador de acordo com as necessidades do estudo.

5. Sacrifício, para posterior análise

1. Colocar o animal numa gaiola ligada a um dispositivo de administração de CO _2.
2. Defina o dispositivo em um 5ciclo-min de inalao de CO _2.
3. Quando a eutanásia é feito, recolher os órgãos de interesse e congelá-los directamente em gelo seco para posterior análise (por exemplo, a medição dos níveis de citocinas em extractos de baço usando um rato de TH1 / TH2 9-Plex ensaio) ^3.

Resultados

Nível de TNFa e Interleucina-1β (IL-1β) depois de aumentar o espaço de tempo após a cirurgia e a diminuição da dose de LPS

Como mostrado previamente, utilizando o protocolo original, VNS diminuiu os níveis de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg em SHAM contra 39,7 ± 10,8 pg / mg em VNS, p <0,001) e IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg em SHAM contra 191,7 ± 27,2 pg / mg em VNS, p <0,01) no baço após injecção intraperitoneal...

Discussão

Desde a sua descoberta no início de 2000, os mecanismos da PAC, foram exaustivamente estudados. Temos agora uma boa imagem da via, e em particular, o órgão-alvo, o baço, onde NE, as células T de memória, Ach, e macrófagos trabalho em equipa muito eficiente para regular negativamente a mediadores inflamatórios ^2. Temos também recentemente publicada dados sobre a importância de um sistema funcional de prostaglandinas em ratinhos, em particular, de PGE _2, que é, obviamente, um ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden