El aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de LPS para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias Limited

Resumen

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Resumen

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).

The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Introducción

La inmunidad innata proporciona una primera línea inmediata de defensa contra las infecciones y enfermedades en una amplia gama de organismos. No sólo se inicia la respuesta inmune primaria para eliminar la amenaza, sino que también desempeña un papel fundamental en la activación y educar a la inmunidad adaptativa que lleva a cabo respuestas inmunes secundarias de una manera específica del patógeno. La inflamación está orquestada por una gran cantidad de citocinas y quimiocinas, que a su vez tienen la capacidad de atraer otras células inmunitarias al sitio de la infección y para inducir los signos cardinales de la inflamación, tales como enrojecimiento, hinchazón, dolor, pérdida de función, y la fiebre . La duración y la intensidad de la inflamación dependen de varios factores, pero la resolución de la inflamación y la restauración de la homeostasis es un paso crítico para evitar la aparición de enfermedades inflamatorias crónicas. Los recientes avances en el campo de la neurología y la inmunología han desentrañado los mecanismos neuronales específicos con un inmenso potencial terapéutico para controlar la inflinflamación tanto en el sistema nervioso central y en la periferia. Uno de estos mecanismos es la vía anti-inflamatorio colinérgico (CAP), también conocido como el reflejo inflamatorio, que es accionado por el sistema nervioso autónomo ^{4, 5.}

Actualmente se cree que los mediadores inflamatorios activan los nervios sensoriales y envían señales sobre el estado de la inflamación en el sistema nervioso central. Una respuesta refleja se activa a continuación, a través del nervio vago eferente. Un extenso estudio sobre los detalles anatómicos de la PAC ha revelado un modelo parasimpático-simpático compuesto de dos nervios, el nervio vago y el nervio esplénico, respectivamente ^6. En el PAC, el colinérgico nervio vago eferente activado termina en el ganglio celíaco-mesentérica, lo que resulta en la activación del nervio esplénico adrenérgico por un mecanismo aún no se ha explorado. El nervio esplénico, activado de este modo, se sabe que internaVate en estrecha proximidad a las células inmunes en la pulpa blanca, de la zona marginal, y la pulpa roja del bazo, el órgano principal y obligatoria de la PAC ^{7, 8.} La norepinefrina (NE) a partir de las terminaciones nerviosas esplénicas se une a los correspondientes receptores adrenérgicos β ₂ expresados en los linfocitos T esplénicas. Esto induce la liberación de colina acetil transferasa (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que a su vez activa los receptores nicotínicos de acetilcolina a7 (α7nACh) sobre los macrófagos, lo que limita la producción de citoquinas y la inflamación ^2. En consecuencia, ahora está claro que el sistema nervioso es capaz de regular la inflamación en los tejidos periféricos y restaurar la homeostasis inmune local.

Como el nombre de la vía sugiere, el sistema de ACh es de importancia fundamental para el funcionamiento de esta vía de regulación neuro-inmune. Curiosamente, los mecanismos implicados en la activación dela PAC parece ser diferente en la periferia y en el sistema nervioso central. Si bien la importancia de los receptores nicotínicos (α7nAChR) en el bazo se ha demostrado anteriormente ^9, los receptores muscarínicos (mAChR) son obligatorios para la activación central de la vía ^{10, 11.} Más recientemente, la administración periférica de un agonista muscarínico M1 de acción central suprimió significativamente suero y tumorales bazo factor de necrosis α (TNF) durante la endotoxemia letal murino, una acción que requiere nervio vago intacto y el nervio esplénico de señalización ^12. También hemos demostrado recientemente que los ratones que carecen de la prostaglandina E ₂ (PGE ₂₎ no fueron capaces de responder a la estimulación del nervio vago y no disminuye la liberación inducida por LPS de citoquinas en el suero y el bazo ^3. Por lo tanto, la PAC también puede ser regulada por sistemas distintos de la principal pathw AChsí.

El nervio vago ha sido nombrado como tales debido a su curso errante en el cuerpo, que inervan los órganos principales incluyendo el hígado, pulmón, bazo, riñones, y el intestino ^13. Teniendo en cuenta este gran inervación y el efecto inmunosupresor muy potente del nervio vago, el potencial terapéutico de la PAC podría cubrir un amplio rango de condiciones inflamatorias. El nervio vago puede ser eléctricamente (o mecánicamente) activado, con el control de la tensión y la frecuencia, y contrariamente al tratamiento convencional, sin fármacos añadidos al cuerpo. Actualmente se están realizando ensayos en pacientes reumáticos, por ejemplo, para probar la significación clínica de la estimulación del nervio vago en el tratamiento de la inflamación crónica ^14. En total, la comunicación y la regulación de la inflamación neuro-inmune están actualmente bajo investigación, que proporcionará un tratamiento posible alternativa a la terapia convencional. Por lo tanto, el análisis de la estimulación del nervio vagon efecto en los diferentes órganos inervados, sino también la caracterización del potencial de acción terapéutica en modelos animales de inflamación crónica, sin duda dar ideas y la esperanza de nuevas dianas terapéuticas potenciales.

La metodología original desarrollado por Tracey y sus colegas ⁴ no podía aplicarse a nuestro campo de la investigación debido a la sobre-estimulación de la respuesta inflamatoria (por una dosis letal de LPS) y un intervalo de tiempo demasiado corto entre la activación de la PAC y de la lectura de salida. En el presente trabajo, presentaremos los cambios realizados en el protocolo original, comparar las dos metodologías diferentes en los niveles de citoquinas, y poner de relieve una nueva y opuesta de observación en el órgano diana (bazo).

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales aprobados por el Comité de Ética local en el Instituto Karolinska, Estocolmo. El Comité de Ética local sigue las directrices de la Unión Europea sobre el cuidado de los animales.

NOTA: Los principales cambios desde el protocolo original son el tiempo de recuperación después de la cirugía (6 hr frente a 1 hr) y el nivel de LPS inyectados (2 mg / kg frente a 15 mg / kg). De lo contrario, los diferentes ajustes relacionados con la cirugía en sí no se han cambiado.

1. Preparar el material para la estimulación

1. Encender el ordenador y el sistema de adquisición de datos vinculados a la electrodo de estimulación (Figura 1A).
2. Abra el programa de Reconocimiento.
3. Preparar una solución madre de LPS a una concentración de 5 mg / ml en 1X PBS, alícuota, y almacenarlo a -20 ° C. En el día del experimento, descongelar una alícuota y preparar un ademuestra cuada de LPS (0,5 mg / ml) con el fin de inyectar alrededor de 100 l en el animal, de acuerdo con el peso.

2. Preparación del animal para la anestesia

1. Utilice ratones C57BL / 6. Mantener ellos en condiciones de clima controlado con un ciclo de luz de 12 h / oscuridad, alimentarlos comida estándar para roedores, y darles agua ad libitum.
2. Realizar la cirugía en ratones que pesan alrededor de 25 g en el día del experimento.
   Nota: Cuando se inducen reacciones inflamatorias, es particularmente importante para llevar a cabo revisiones regulares y observaciones de las reacciones clínicos en los animales. Se necesita la eutanasia prematura mediante inhalación de _CO2 si la condición animal no cumple los criterios éticos.
3. Ajuste la máquina de anestesia.
   1. Asegúrese de que el tubo está conectado correctamente y no está dañado de alguna manera. Asegúrese de que el área de ventilación está funcionando correctamente. Conectar el filtro llave de la botella de isoflurano y llene el vaporizer con una cantidad suficiente de isoflurano.
   2. Abra el suministro de gas (aire y oxígeno) y asegúrese de que las botellas contienen suficiente gas para el experimento. Un conector de tres vías es entonces capaz de enviar el flujo de isoflurano a la cámara de inducción o la máscara.
4. Gire el conector de tres vías a la cámara de inducción. Elige una ratón de la jaula hogar e insertar el animal en la cámara. Ajuste el regulador de flujo de 1,0 L / min de oxígeno y 1,0 L de aire / min. Ajustar la concentración de isoflurano al 4 - 5%.
5. Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, afeitar el área quirúrgica y mover el animal de la cámara a la máscara. Gire el conector de tres vías para el flujo máscara. Ajuste el regulador de flujo de 0,25 L / min de oxígeno y 0.25 L de aire / min.
   1. Ajustar la concentración de isoflurano a 1.5 a 2.5%. Comprobar el nivel de anestesia por control reflejo y la frecuencia respiratoria antes de iniciar el procedur quirúrgicomi.
6. Fije las patas del ratón al banco de trabajo utilizando cinta adhesiva. Asegúrese de que la nariz del animal está siendo cuidadosamente colocado en la máscara.

3. Cirugía y la estimulación del nervio vago

1. Desinfectar el área quirúrgica con 70% de etanol.
2. El uso de un escalpelo, incisión cuidadosamente la piel a nivel del cuello (incisión de alrededor de 1 a 1,5 cm).
   Nota: En el protocolo, el procedimiento de cirugía termina aquí para los animales con operación simulada. De hecho, se ha demostrado que apenas tocando el nervio con una herramienta de metal ya que estimula, en cierta medida. Por lo tanto, para obtener un animal de control cirugía más precisa cuando se utiliza una pequeña cantidad de LPS, detener la cirugía en este paso.
3. Con la ayuda de un microscopio (objetivo 12,5X), aislar el nervio vago izquierdo desde la arteria carótida usando fórceps de disección. En primer lugar localizar el músculo esternocleidomastoideo mediante la eliminación de capas de la piel y la grasa, y luego retractarse enfin de poner las pinzas detrás de tanto nervio y la arteria.
   Nota: El siguiente paso es muy complicado, ya que el nervio y la arteria están estrechamente adheridas entre sí. Por lo tanto, es muy fácil de cortar el vaso y matar al animal. Sin embargo, mediante la colocación de las pinzas con mucho cuidado entre el nervio y la arteria, con el tiempo se separan, y es posible aislar el nervio.
4. Coloque el electrodo (Figura 1B) bajo el nervio vago. El electrodo de aguja es bastante largo, por lo que incluso si el nervio se mueve ligeramente durante la estimulación, siempre estará en contacto con el electrodo.
5. Realizar una inyección intraperitoneal (ip) de LPS (2 mg / kg) con la ayuda de una jeringa (para la lectura de salida en los niveles de citoquinas, es decir, para medir el efecto de regulación hacia abajo).
6. Esperar 5 min antes de comenzar la estimulación.
7. Estimular el nervio vago durante 5 min a 5 V y 1 Hz pulsando el botón de inicio en el programa Reconocer.
8. Remover el electrodo y suturar la herida del animal con hilo de sutura quirúrgica.
9. Rociar una Película Barrera No Irritante (PBNI) sobre la herida con el fin de mejorar la cicatrización y para protegerse de las infecciones.

4. Recuperación de los Animales

1. Después de la cirugía, mover al animal a su jaula para despertar y recuperación. Bajo la luz de infrarrojos con el fin de mantener la temperatura corporal, asegúrese de controlar al animal hasta la plena conciencia se ha recuperado.
2. Deje que el animal se recupere en su jaula durante 6 horas antes del sacrificio para el análisis.
   Nota: El efecto de la estimulación del nervio vago es muy rápido y también se ha demostrado que ser de larga duración (hasta 48 h), por lo que el tiempo de recuperación puede ser establecido por el experimentador de acuerdo con las necesidades del estudio.

5. Sacrificio para su posterior análisis

1. Colocar el animal en una jaula vinculado a un dispositivo de administración de CO _2.
2. Permite configurar el dispositivo en un 5ciclo -min de inhalación de _CO2.
3. Cuando se realiza la eutanasia, recoger los órganos de interés y congelar directamente en hielo seco para análisis adicional (por ejemplo, la medición de los niveles de citoquinas en los extractos de bazo usando un TH1 ratón / TH2 ensayo 9-Plex) ^3.

Resultados

Nivel de TNF y la interleucina-1β (IL-1β) después de aumentar la Lapso de tiempo después de la cirugía y la disminución de la dosis de LPS

Como se indica anteriormente, utilizando el protocolo original, VNS disminuyó los niveles de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg en SHAM frente a 39,7 ± 10,8 pg / mg en VNS, p <0,001) y la IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg en SHAM frente a 191,7 ± 27,2 pg / mg en VNS, p <0,01) en el bazo d...

Discusión

Desde su descubrimiento en la década de 2000, los mecanismos de la PAC han sido estudiados a fondo. Ahora tenemos una buena imagen de la vía y, en particular, el órgano diana, el bazo, donde NE, las células T de memoria, Ach, y macrófagos trabajo como un equipo muy eficiente para regular a la baja mediadores inflamatorios ^2. También hemos publicado recientemente datos sobre la importancia de un sistema de prostaglandina funcional en ratones, en particular, PGE _2, que es obviament...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Toshiba	-	Any computer is actually compatible
MP-150 data acquisition system	Biopac Systems	MP150WSW
Acknowledge software	Biopac Systems
Mice C57Bl/6	Charles River
Anesthetic machine	Simtec Engineering
Medical oxygen bottle	AGA	107563
Medical air bottle	AGA	108639
Vetflurane (1,000 mg/g)	Virbac	137317
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
Saline	Merck Millipore	1024060080
PBS 10x	Sigma-Aldrich	P5493	Diluted 10 times for used concentration
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	303172
Needles 23 G	KD-FINE	900284	0.6 x 30 mm (blue)
Microdissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Surgical suture 4-0	Ethicon	G667G
Euthanasia unit	Euthanex Smartbox	EA-32000
Cavilon No Sting Barrier Film	3M Health Care	3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit	MesoScale Discovery	K15013C-1
Stimulating electrode device	Biopac Systems	STIMSOC
Aesculap Isis shaver	Agnthos	GT420
R70			Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden