حيوي داخلي المجهري والجلطة التعريفي في شحمة الأذن ماوس بلا شعر

Summary

نموذج الأذن للأصلع الماوس SKH1-HR ^ساعة تمكن المجهر مضان حيوي داخلي من دوران الأوعية الدقيقة والضوئي السمي تحريض الجلطة دون إعداد مسبق الجراحية في السرير الاوعية الدموية الدقيقة فحصها. ولذلك، فإن أذن الفأر أصلع هو ممتاز في نموذج الجسم الحي لدراسة التفاعلات المعقدة خلال تشكيل خثرة الاوعية الدموية الدقيقة، وتطور الجلطة، والجلطات.

Abstract

مضاعفات الجلطات من أمراض الأوعية الدموية هي السبب واحد رئيسي للمراضة والوفيات في الدول الصناعية. بسبب التفاعلات المعقدة بين مكونات الدم الخلوية وغير الخلوية خلال تشكيل خثرة، دراسات موثوقة من علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لتجلط الدم لا يمكن إلا أن يؤديها في الجسم الحي. لذلك، تقدم هذه المقالة نموذج الأذن لدى الفئران أصلع وتركز على التحليل في الجسم الحي من دوران الأوعية الدقيقة، وتشكيل خثرة، وتطور الجلطة. باستخدام المجهر مضان حيوي داخلي والوريد (د) تطبيق الأصباغ الفلورية منها، تحليل المتكرر للدوران الأوعية الدقيقة في الأذن يمكن بسهولة أن يؤديها، دون الحاجة إلى إعداد الجراحية. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج يمكن تكييفها للدراسات في الجسم الحي من القضايا المختلفة، بما في ذلك التئام الجروح، وإصابة ضخه، أو الأوعية الدموية. وباختصار، فإن أذن الفئران أصلع هو النموذج المثالي للفي فيفدراسة س من دوران الأوعية الدقيقة الجلد في الظروف الفسيولوجية أو المرضية في جسم المريض ولتقييم رد فعلها على العلاجات الموضعية أو الجهازية مختلفة.

Introduction

والغرض من هذه المادة هو لوصف أسلوب intravital المجهري تطبيقها على صوان الماوس أصلع لالملاحظة المباشرة وتحليل دوران الأوعية الدقيقة، وتشكيل خثرة، وتطور الجلطة. مع معدل الإصابة من 1 في 1000، تخثر وريدي لا يزال سبب شائع للالاعتلال. على الرغم من أن التشخيص، واستراتيجيات الوقاية، والعلاج تم تطويرها في السنوات الأخيرة، وثلث من الخثار الوريدي يظهر كما الانسداد الرئوي ^1. تجلط الدم الشرياني يلعب دورا حاسما في أمراض القلب والشرايين، والتي هي السبب الأكثر شيوعا للوفاة في الدول الصناعية. وتشارك تجلط الدم الشرياني على أساس تمزق لويحات تصلب الشرايين في النوبات القلبية واحتشاء المساريقي، وسكتة. كل جراحة تكشف هياكل تحت البطانة لمكونات الدم، تغير ديناميات تدفق الدم، ويشل المريض. في جراحة endoprosthetic من الطرف السفلي، تي الجهازransplantation والجلطة جراحة رفرف هي أسباب كثرة حدوث مضاعفات. تخثر الاوعية الدموية الدقيقة على وجه الخصوص في كثير من الأحيان يسبب ضررا لا يمكن إصلاحه، وذلك بسبب عدم وجود أعراض سريرية. وبالمثل، تخثر الاوعية الدموية الدقيقة يلعب قاعدة مهمة في العديد من الأمراض، بما في ذلك فرفرية نقص الصفيحات الخثاري، وتعفن الدم، تخثر داخل الأوعية الدموية، متلازمة الفوسفولبيد، والقصور الوريدي المزمن وغيرها.

وقد وضعت العديد من الأدوية الجديدة لعلاج والوقاية من الجلطة في السنوات الأخيرة، ولكن الأدوية المضادة للصفيحات ومضادات التخثر لا يزال لديها آثار جانبية، مضادات نقص، وميزة آثار مدة طويلة. هذه العيوب تؤدي إلى مشاكل في مجال الرعاية الطبية الطارئة. وبالتالي، هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لكشف العمليات المعقدة التي تحدث أثناء تخثر الدم، والتي بالكاد يمكن محاكاتها في المختبر.

تم اكتشاف أصلع SKH1-HR ^ساعة الماوس 1926 في حديقة للحيوانات في لندن.بسبب وجود خلل الجينات على الكروموسوم 14، يفقد الحيوان الفراء، بعد يوم بعد الولادة 10. وهذا يجعل من صوان-أوعية دموية جيدة للوصول إلى intravital المجهري للأوعية الدموية. متوسط ​​سمك الأذن هو 300 ميكرون. وهو يتألف من طبقتين من الأدمة، والتي تكون مفصولة الغضروف. على الجانب الظهري محدب من الغضروف، 3 الحزم الوعائية تدخل شحمة الأذن. أقواس الأوعية الدموية قمي ويحول القاعدية ربط الحزم الثلاث. والأوردة لها بأقطار تتراوح بين 200 ميكرون (القاعدية) و 10 ميكرون (القمي). الشعيرات الدموية إغلاق مزجها، تحيط الشعر فارغة بصيلات ^2. تشريح أصلع SKH1-HR ^ساعة الماوس يجعل من صوان نموذج قوي وفعال من حيث التكلفة للأبحاث تجلط الدم.

Protocol

أجريت جميع التجارب في الجسم الحي (7221.3-1-006 / 15) وفقا للتشريع الألماني على حماية الحيوانات ودليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد الثروة الحيوانية مختبر، المجلس الوطني للبحوث).

1. مسك العام للحيوانات

1. إجراء التجارب مع الفئران الذكور ^ساعة SKH1-HR تتراوح أعمارهم بين 4 إلى 6 أسابيع. استخدام الحيوانات وزنها ما بين 20 و 25 غراما.
2. الحفاظ على الحيوانات في منشأة خالية من مسببات الأمراض وتحت ظروف قياسية من 24 إلى 26 درجة مئوية، والرطوبة النسبية حوالي 60٪، مع وصول مستمر إلى الماء والغذاء الإرضاع بحسب الرغبة.
3. إبقاء ما يصل إلى خمسة ذكور الحيوانات في قفص واحد. توفير الفراش والمواد الإثرائية خلال السكن في الحيوانات لرفاههم.

2. بترتيب مسبق من الحيوانات

1. وزن الماوس وتحميل المخدرات منها (على سبيل المثال، والقنب، 5 مز / كغ من وزن الجسم (وزن الجسم)) في حقنة الأنسولين. إدارة دقيقة المخدرات 30 قبل الاستقراء الجلطة.
2. من خلال عقد رقبة الفأر بين الإبهام والسبابة وذيل الفأر مع الاصبع الصغير، وتمتد الحيوان وحقن المخدرات داخل الصفاق (IP) في الربع الأيسر السفلي من البطن. وضع الحيوان مرة أخرى في قفص لمدة 15 دقيقة.
3. إعداد التخدير مع الكيتامين (90 ملغ / كغ من وزن الجسم) وزيلازين (25 ملغ / كغ من وزن الجسم). 15 دقيقة قبل تحريض الجلطة، تخدير الماوس. ضع الماوس في القفص، وسحب الذيل قليلا، وحقن التخدير الملكية الفكرية مع حقنة الأنسولين.
4. وضع الماوس مرة أخرى في قفص حتى بداية التخدير. للتحقق من التخدير الكافي، قرصة الذيل مع ملقط.
5. تحميل 0.05 مل من ديفروستيد فلوريسئين ديكستران المسمى ثيوسيانات (FITC-ديكستران، 5٪، و 150 كيلو دالتون) في حقنة الأنسولين. في حين ملء الحقنة، وضمان أن تبقى أي فقاعات الهواء، لأن intravenousl حتى الصغيرةص (د) فقاعات الهواء -administered يمكن أن تكون قاتلة للحيوان.
6. ضع الماوس تخدير على طبق من التدفئة في موقف لأسفل. ضبط لوحة التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
7. وضع مرهم العين على القرنية من الفأرة. تطهير الجلد واستخدام أدوات معقمة.
8. غرزة اثنين من خيوط البولي بروبيلين 7/0 إلى حافة الجمجمة والذيلية من الأذن اليمنى. وضع غرز أقرب إلى الحافة، وكما الأقرب إلى قاعدة ممكن (الشكل 1B).
9. تحويل الماوس لموقف الظهرية. إصلاح جميع الساقين إلى منصة acrylglass باستخدام شرائط لاصقة. ربط الخيط تحت أسنان الأمامية ووضع الرأس في عطف ظهري عن طريق الالتزام خياطة لacrylglass مع شرائط لاصقة.
10. نقل من الحيوان على منصة تحت مجهر تشريحي العملية. استخدام 16X التكبير.

3. إعداد اليسار الوداجي الوريد وحقن FITC-ديكستران

ملاحظة: لهيئة التصنيع العسكريroscopy من الأذن اليمنى، وإعداد حبل الوريد الأيسر.

1. باستخدام مشرط، إنشاء شق 5 ملم في الجلد في الجانب الأيسر من الرقبة في اتجاه القحف الذيلية. تشريح الأنسجة تحت الجلد مع microforceps وmicroscissors. أما السفن العابرة ligate مع البوليستر 8/0 الغرز أو مع الكهربي.
2. تحرير الوريد من البرانية وذلك باستخدام microforceps وmicroscissors دون لمس السفينة.
3. استخدام حقنة الأنسولين التي أعدت للحقن صبغة الفلورسنت. بعناية والاستيلاء على جدار الوعاء الدموي مع microforceps، دون ثقب الوريد. اختراق جدار الوعاء الدموي منفوخ مع حقنة وحقن الرابع FITC-ديكستران.
4. وقف النزيف بعد سحب الحقنة باستخدام قطعة قطن. تجنب الدم وصبغ تلوث الأذن.

4. تحديد المواقع من الأذن اليمنى لحيوي داخلي الإسفار المجهر

1. نقل الحيوانات على لوحة التدفئة إلى acrylglass جonstruction مع فتحة لوحة التدفئة وطائرة 0.5 سم عالية لتحديد المواقع الأذن.
2. إصلاح وجه الحيوان لأسفل على لوحة التدفئة باستخدام شرائط لاصقة. وضع الغضروف قوي نسبيا ومحدب في قاعدة الأذن بجانب الطائرة 0.5 سم عالية للأذن (الشكل 1B) بحيث الجزء القمي من الأذن يمكن وضعه شقة على متن الطائرة.
3. إضافة قطرة واحدة من درجة حرارة الغرفة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى الطائرة acrylglass من أجل وضع الأذن. وضع الأذن اليمنى، مع الغرز ترتيبها مسبقا على الجانب البطني مقعر بها إلى أسفل، على انخفاض بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم. باستخدام قطعة قطن، واستيعاب قطرة من كلوريد الصوديوم والسماح القوات الشعرية نعلق الطائرة الأذن إلى acrylglass.
4. الشريط الغرز إلى acrylglass لتحديد موقف من الأذن.
5. إضافة قطرة واحدة من 0.9٪ درجة حرارة الغرفة كلوريد الصوديوم إلى الجانب الظهري محدب من الأذن. وضع بعناية ساترة واحدة (0.5 سم القطر) على الأذن دون ضغط الأوعية القاعدية دخول عشرالبريد الأذن. باستخدام قطعة قطن، وإزالة كلوريد الصوديوم قدر الإمكان من تحت ساترة من أجل تقليل المسافة بين ساترة والأوعية الهدف الأذن.

5. حيوي داخلي الإسفار المجهري والجلطة تحريض الأذن اليمنى

1. ضبط المجهر مضان حيوي داخلي التصور FITC-ديكستران (450-490 نانومتر، FT: 510، LP: 520). استخدام مصباح الزئبق 100-W متغير كمصدر ضوء. توصيل عالية الدقة، بالأسود والأبيض كاميرا CCD لمسجل DVD.
2. نقل الحيوانات على acrylglass تحتوي على لوحة التدفئة مع الأذن خطف الثابتة إلى مكتب المجهر مضان حيوي داخلي.
3. باستخدام 20X التكبير (20X / 0.95 الفتحة العددية) و 20٪ شدة الضوء، والبحث عن وعاء الوريدية 50 - 60 ميكرون في القطر ومع تدفق الدم تقدمي من 400-600 ميكرون / ثانية.
4. إضافة قطرة واحدة من الماء درجة حرارة الغرفة إلى ساترة لغمر المياه للmagnificatio 63Xالهدف ن (63X / 0.95 الفتحة العددية). استخدام المحاقن مع قطر قنية 1 ملم ووضع قطرة على هدف المجهر. يضاف الماء ما يكفي للاتصال ساترة والهدف مع قطرة الماء.
5. مباشرة بعد تطبيق قطرة الماء، بدء تسجيل السفينة في 20 ثانية مع شدة الضوء 20٪ لقياس حاليا من تدفق قطر والدم.
6. بدء خثرة تحريض 5 دقائق بعد حقن FITC-ديكستران. لهذا الغرض، ورفع شدة الضوء إلى 100٪.
7. خلال تحريض الجلطة، أغلق فتحة المجهر ل2 ثانية خلال مدة 30 ق للتحقق من تدفق الدم. في حالة استمرار تدفق الدم، وفتح فتحة مرة أخرى. في حالة توقف تدفق الدم، ومراقبة السفينة لمدة 30 ثانية.
   ملاحظة: يصنف السفينة كما المغطي إذا كان التدفق لا يزال قائما لمدة 30 ثانية أو أكثر أو إذا تدفق الدم retrogradely. إذا بدأ تدفق الدم منتصب المشية مرة أخرى، فتح تماما الفتحة وcontin رق تحريض خثرة حتى يحدث انسداد الأوعية كما هو موضح أعلاه. خلال تحريض خثرة في وقت مبكر، تأكد من أن الأوقات التي تم إغلاق الفتحة للتحقق من تدفق الدم قصيرة قدر الإمكان من أجل الحفاظ على استمرار تقريبا برنامج التحصين الموسع في الإضاءة. وفي وقت لاحق، خلال نمو الجلطة، وperfused لالسفينة مع أقل صبغة الفلورسنت، لذلك يمكن ملاحظتها بشكل مستمر.
8. اختيار وحبس 5 سفن في الأذن. يحدد الوقت الحث خثرة تحت المجهر لحوالي 1 ساعة بعد الحقن من FITC-ديكستران.

6. أنشطة المتابعة

1. إجراء إغلاق الجرح في الرقبة باستخدام البولي بروبلين عبر الجلد 6/0 الغرز.
2. خلال التعافي من التخدير، ووضع الماوس مرة أخرى في قفص وتدفئة الحيوان باستخدام الأشعة تحت الحمراء.
3. نقل البيانات المسجلة من مسجل دي في دي لبرنامج يسمح للقياس قطر السفن وسرعة تدفق الدم.

_title "> 7. فحص الأذن اليسرى

1. السماح للحيوان على التعافي والقضاء على كل حقن FITC-ديكستران لمدة 48 ساعة.
2. أعد الخطوات المذكورة أعلاه، وهذه المرة إعداد حبل الوريد الأيمن والأذن اليسرى.

8. الأنسجة Asservation

1. بعد الفحص المجهري مضان حيوي داخلي من الأذن اليسرى، عينة 0.5 مل من الدم من الوريد الضفيرة خلف المقلة للعين باستخدام الزجاج الشعرية. بعناية اختراق زاوية الجفن الداخلية مع حركات الشد، حتى يتدفق الدم الوريدي من خلال الشعيرات الدموية. جمع التحقيق في أنبوب الدم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA).
2. بعد اخذ عينات من الدم، التضحية الحيوانية عن طريق حقن 500 ملغ / كغ من وزن الجسم الكيتامين في الوريد الذيل.
3. عدد خلايا الدم باستخدام محلل أمراض الدم لإجراء تقييم كمي لكريات الدم البيضاء، خلايا الدم الحمراء، thrombocytes، الهيموجلوبين، والهيماتوكريت.
4. أجهزة الطرد المركزي الدم EDTA المتبقية في 2500 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 مفي. ماصة وتجميد بلازما الدم لإجراء مزيد من التحقيقات.
5. باستخدام مقص، وقطع الأذين واصلاحها في 4٪ الفورمالديهايد للفحص النسيجي.

النتائج

آثار القنب العلاج على تكون الخثرات

على حقن 0.05 مل من FITC-ديكستران، خثرة الضوئي السمي تحريض يؤدي إلى آفة البطانية وتشكيل المكونات الصفائح الدموية الجداري (الشكلان 2 و 3). في هذه الد...

Discussion

هناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح تحريض خثرة في شحمة الأذن من الفئران ^ساعة SKH1-HR. استكشاف الأخطاء وإصلاحها، يشار إلى الخطوات كل من بروتوكول بين قوسين.

شروط الفحص مثالية في الحيوانات الصغيرة في سن 4-6 أسابيع ومع التقرن المنخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0.5 cm high plane