Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo

Resumo

O modelo orelha do rato SKH1-hr ^hr sem pêlos permite a microscopia de fluorescência intravital da microcirculação e indução trombo fototóxico sem preparação cirúrgica prévia no leito microvascular examinado. Portanto, a orelha do rato sem pêlo é um excelente modelo in vivo para estudar as interacções complexas durante a formação do trombo microvascular, evolução de trombos, e trombólise.

Resumo

complicações trombóticas de doenças vasculares são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em países industrializados. Devido às interacções complexas entre os componentes celulares do sangue e não celulares durante a formação de trombos, os estudos fiáveis da fisiologia e patofisiologia da trombose só pode ser realizado in vivo. Por conseguinte, o artigo apresenta um modelo de orelha em ratinhos pelados e centra-se na análise in vivo da microcirculação, a formação de trombos, e evolução de trombos. Por meio de microscopia de fluorescência intravital e a administração intravenosa (iv) aplicação dos respectivos corantes fluorescentes, a análise repetitiva de microcirculação na aurícula pode ser facilmente realizada, sem a necessidade para a preparação cirúrgica. Além disso, este modelo pode ser adaptado para os estudos in vivo de diferentes problemas, incluindo a cicatrização de feridas, lesão de reperfusão, ou angiogénese. Em resumo, a orelha de ratinhos sem pêlo é um modelo ideal para a em vivO estudo da microcirculação da pele em condições fisiológicas ou fisiopatológicos e para a avaliação da sua reacção a diferentes tratamentos tópicos ou sistémicos.

Introdução

O objectivo do presente artigo é descrever a técnica de microscopia intravital aplicado à aurícula do ratinho sem pêlos para a observação directa e análise da microcirculação, a formação de trombos, e evolução de trombos. Com uma taxa de incidência de 1 em 1.000, trombose venosa ainda é uma causa comum de morbidade. Embora diagnósticos, estratégias de prevenção e terapias têm sido desenvolvidos nos últimos anos, um terço de trombose venosa manifesta como uma embolia pulmonar ^1. trombose arterial desempenha um papel crítico nas doenças cardiovasculares, que são a causa mais comum de morte nos países industrializados. trombose arterial a partir da ruptura de placas ateroscleróticas é envolvida em ataques cardíacos, enfarte do mesentéricos, e apoplexia. Toda cirurgia expõe estruturas subendotelial para componentes do sangue, muda a dinâmica do fluxo sanguíneo, e imobiliza o paciente. Na cirurgia de endoprese do membro inferior, t órgãoransplantation e trombose cirurgia de retalho são causas frequentes de complicações. trombose microvascular em particular frequentemente provoca danos irreversíveis, devido à falta de sintomas clínicos. Da mesma forma, trombose microvascular desempenha uma regra fundamental em várias doenças, incluindo púrpura trombocitopênica trombótica, septicemia, coagulação intravascular disseminada, síndrome antifosfolípide, e insuficiência venosa crônica, entre outros.

Vários novos medicamentos para a terapia e prevenção de trombose foram desenvolvidos nos últimos anos, mas os fármacos antiplaquetários e anticoagulantes ainda ter efeitos colaterais, antagonistas falta, e apresentam efeitos de longa duração. Essas deficiências levar a problemas nos cuidados médicos de emergência. Assim, é necessária mais investigação para descobrir os processos complexos que ocorrem durante a trombose, que dificilmente pode ser simulada in vitro.

O mouse sem pêlos ^hr SKH1-Hr foi descoberto 1926, em um zoológico em Londres.Devido a um defeito no gene no cromossomo 14, o animal perde a sua pele após dia pós-natal 10. Isso faz com que a aurícula bem vascularizado acessível a microscopia intravital dos vasos. A espessura média da orelha é 300 um. É constituída de duas camadas de derme, que são separados por cartilagem. No lado dorsal convexa da cartilagem, 3 feixes vasculares introduzir o lóbulo da orelha. arcos vasculares apicais e derivações basais conectar as três pacotes. As vénulas têm diâmetros entre 200 um (basal) e 10 m (apical). Capilares Close-malha cercam o cabelo vazia folículos ^2. A anatomia do rato ^hr SKH1-Hr sem pêlos faz com que a aurícula um modelo poderoso e rentável para a pesquisa trombose.

Protocolo

Todos os experimentos in vivo (7221.3-1-006 / 15) foram conduzidos de acordo com a legislação alemã sobre a protecção dos animais e o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources, Conselho Nacional de Pesquisa).

1. Manter geral dos animais

1. Realizar as experiências com ratinhos ^hr SKH1-hr sexo masculino com idades entre 4 a 6 semanas. Utilizar animais com um peso entre 20 e 25 g.
2. Manter os animais em uma facilidade livre de organismos patogénicos e sob condições padronizadas de 24 a 26 ° C e cerca de 60% de humidade relativa, com acesso contínuo à água e comida ad libitum.
3. Mantenha-se cinco animais machos em uma gaiola. Fornecer roupa de cama e material de enriquecimento durante o alojamento dos animais para o seu bem-estar.

2. prearrangement dos Animais

1. Pesar um rato e carregar o respectivo fármaco (por exemplo, o canabinóide, 5 mg / kg de peso corporal (BW)) para uma seringa de insulina. Administrar o fármaco 30 min antes da indução de trombos.
2. Ao segurar o pescoço do rato entre o polegar e o dedo indicador e a cauda do rato com o dedo mindinho, esticar o animal e injectar a droga por via intraperitoneal (ip) no quadrante inferior esquerdo do abdómen. Colocar o animal de volta para dentro da gaiola durante 15 minutos.
3. Prepare anestesia com cetamina (90 mg / kg de peso corporal) e xilazina (25 mg / kg de peso corporal). 15 min antes da indução de trombos, anestesiar o rato. Colocar o rato na gaiola, puxar a cauda ligeiramente, e injectar o ip anestésicos com uma seringa de insulina.
4. Coloque o mouse de volta para a jaula até o início da anestesia. Para verificar a anestesia suficiente, beliscar a cauda com uma pinça.
5. Carga de 0,05 ml de descongelado dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano; 5%, 150 kDa) para uma seringa de insulina. Ao encher a seringa, assegurar que nenhuma bolha de ar permanece, porque mesmo pequenas intravenouslY (iv) as bolhas de ar -administered pode ser letal para o animal.
6. Colocar o rato anestesiado numa placa de aquecimento na posição de barriga para baixo. Ajustar a placa de aquecimento a 37 ° C.
7. Coloque pomada sobre a córnea do mouse. Desinfectar a pele e usar instrumentos esterilizados.
8. Pontos duas suturas de polipropileno 7/0 na extremidade craniana e caudal da orelha direita. Colocar os pontos o mais próximo da extremidade proximal e como para a base quanto possível (Figura 1B).
9. Deslocar o rato a posição dorsal. Fixar todas as pernas para a plataforma de vidro acrílico usando tiras adesivas. Enganchar uma sutura sob os dentes da frente e posicionar a cabeça em flexão dorsal por colagem de fio de sutura para o vidro acrílico com tiras adesivas.
10. Translocar o animal na plataforma sob o microscópio estereoscópico operação. Use ampliação de 16x.

3. Preparação da Esquerda veia jugular e injeção de FITCDextran

Nota: Para microscopy da orelha direita, prepare a veia jugular esquerda.

1. Utilizando um bisturi, criar uma incis de 5 mm na pele do lado esquerdo do pescoço numa direcção cranio-caudal. Dissecar o tecido subcutâneo com um microfórceps e microtesouras. Tanto os navios que atravessavam ligadura com poliéster 8/0 suturas ou com eletrocoagulação.
2. Libertar a veia de seu adventícia usando micropinças e microtesoura sem tocar no navio.
3. Usar a seringa de insulina preparada para a injecção do corante fluorescente. Cuidadosamente pegar a parede do vaso com as micropinças, sem perfurar a veia. Penetram na parede do vaso dilatado com a seringa e injectar iv FITC-dextrano.
4. Parar o sangramento após a retirada da seringa com cotonetes de algodão. Evite sangue e tingir a contaminação da orelha.

4. Posicionamento da orelha direita para Intravital microscopia de fluorescência

1. Transferir o animal sobre a placa de aquecimento para um vidro acrílico construção com uma fenda para a placa de aquecimento e um plano de 0,5 centímetros de alta para o posicionamento da orelha.
2. Corrigir o animal cara para baixo na placa de aquecimento com tiras adesivas. Coloque a cartilagem relativamente forte e convexa na base da orelha ao lado do 0,5 centímetros de alta plano para a orelha (Figura 1B), de modo que a parte apical da orelha pode ser posicionada plana sobre o plano.
3. Adicionar uma queda de temperatura ambiente de NaCl a 0,9% para o plano de vidro acrílico de modo a posicionar a orelha. Coloque a orelha direita, com as suturas preestabelecidos no seu lado ventral côncava voltada para baixo, sobre a gota de NaCl a 0,9%. Usando cotonetes, absorver a gota de NaCl e deixe forças capilares anexar o plano ouvido no vidro acrílico.
4. Tape as suturas ao vidro acrílico para fixar a posição da orelha.
5. Adicionar uma gota de NaCl a 0,9% à temperatura ambiente para o lado dorsal convexa da orelha. colocar cuidadosamente uma lamela (0,5 cm de diâmetro) sobre a orelha, sem comprimir os vasos que entram basais the ouvido. Usando cotonetes, remover tanto quanto possível a partir de NaCl sob a lamela de modo a minimizar a distância entre as lamelas e os vasos alvo orelha.

5. Intravital microscopia de fluorescência e de trombos Indução da orelha direita

1. Ajustar o microscópio de fluorescência para visualização intravital com FITC-dextrano (450-490 nm; FT: 510; LP: 520). Utilizar uma lâmpada de mercúrio de 100 W variável como uma fonte de luz. Ligue um de alta resolução, câmera CCD preto-e-branco a um gravador de DVD.
2. Transferir o animal sobre o vidro acrílico contendo a placa de aquecimento com a orelha sequestrado fixado para a recepção de um microscópio de fluorescência intravital.
3. Usando 20X de ampliação (20x / 0.95 abertura numérica) e 20% da intensidade de luz, procurar um vaso venoso 50 - 60 um de diâmetro e com um fluxo de sangue anterógrada de 400-600? M / s.
4. Adicionar uma gota de água à temperatura ambiente para a lamela para imersão em água do 63x magnificatioobjectivo n (63X / 0,95 abertura numérica). Utilizar uma seringa com uma cânula de diâmetro de 1 mm e colocar a gota sobre a objectiva do microscópio. Adicionar água suficiente apenas para entrar em contato com a lamela eo objetivo com a gota de água.
5. Imediatamente após a aplicação da gota de água, começa a gravar o vaso durante 20 s com 20% de intensidade de luz para a medição desligada do fluxo de diâmetro e sangue.
6. Iniciar indução trombo 5 min após a injecção de FITC-dextrano. Para este fim, aumentar a intensidade de luz a 100%.
7. Durante a indução de trombos, fechar a abertura do microscópio durante 2 s dentro de um período de 30 s para verificar o fluxo de sangue. No caso de persistir o fluxo sanguíneo, abrir a abertura de novo. No caso do fluxo sanguíneo parou, observar o vaso durante 30 s.
   NOTA: O navio é classificada como ocluído se o fluxo fica parado por 30 segundos ou mais ou se o sangue flui retrógrada. Se o fluxo de sangue orthograde começa novamente, abrir completamente a abertura e contin ue a indução trombo até oclusão vascular ocorre como descrito acima. Durante a indução trombo cedo, assegurar que os momentos em que a abertura foi fechada para verificar o fluxo de sangue são tão curto quanto possível, a fim de manter a epi-iluminação quase contínua. Mais tarde, durante o crescimento do trombo, o navio é perfundido com menos corante fluorescente, para que possa ser observado continuamente.
8. Selecione e ocluir 5 navios por espiga. Limitar o tempo de indução de trombos sob o microscópio de aproximadamente 1 h após a injecção de FITC-dextrano.

6. As atividades de acompanhamento

1. Realizar um fecho da ferida do pescoço utilizando polipropileno transcutânea 6/0 suturas.
2. Durante a recuperação da anestesia, o rato colocado de volta para dentro da gaiola e aquecer o animal usando luz infravermelha.
3. Transferir os dados gravados a partir do gravador de DVD para o software que permite a medição do diâmetro dos vasos e velocidade do fluxo sanguíneo.

_title "> 7. Exame da orelha esquerda

1. Deixe o animal recuperar e eliminar todos injectado FITC-dextrano durante 48 horas.
2. Execute novamente os passos descritos acima, desta vez preparando a veia jugular direita e da orelha esquerda.

8. Tecido Asservation

1. Depois de microscopia de fluorescência intravital da orelha esquerda, amostra de 0,5 mL de sangue a partir do plexo retrobulbar veia do olho utilizando um capilar de vidro. Cuidadosamente penetrar o ângulo palpebral interior com movimentos de aparafusamento, até que o sangue venoso flui através do capilar. Recolha a sonda em um tubo de sangue ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
2. Após amostragem de sangue, sacrifício do animal por injecção de 500 mg / kg de peso corporal de cetamina na veia da cauda.
3. Contar as células de sangue utilizando um analisador de hematologia para uma avaliação quantitativa de leucócitos, eritrócitos, trombócitos, hemoglobina e hematócrito.
4. Centrifugar o sangue com EDTA restante a 2.500 x g e à temperatura ambiente durante 10 mem. Pipeta e congelar o plasma sanguíneo para posteriores investigações.
5. Com uma tesoura, corte as aurículas e corrigi-los em formol 4% para exame histológico.

Resultados

Efeitos do Tratamento de canabinóides no Trombogênese

Após a injecção de 0,05 mL de FITC-dextrano, a indução de trombos fototóxico conduz a uma lesão endotelial e a formação de um tampão de plaquetas parietal (Figuras 2 e 3). No presente estudo, a indução de trombos após a injecção ip de canabinóides (5 mg / kg de peso corporal) ou veículo resultaram em uma oclusão vascular tr...

Discussão

Existem vários passos críticos para a indução bem sucedida de trombos no lóbulo da orelha de ratinhos ^hr SKH1-hr. Para solucionar o problema, as respectivas etapas do protocolo estão indicados entre parênteses.

condições de exame são ideais em animais jovens com a idade de 4 - 6 semanas e com baixo cornificao da epiderme. Nos animais mais velhos, a qualidade de visualização dos vasos é pior e menos comparáveis, devido à maior distância entre a superfície da pele e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0.5 cm high plane