Microscopia intravital y trombos de inducción en el lóbulo de la oreja de un ratón sin pelo

Resumen

El modelo de oreja del ratón sin pelo SKH1-Hr ^hr permite microscopía de fluorescencia intravital de la microcirculación y la inducción de trombos fototóxico sin preparación quirúrgica previa en el lecho microvascular examinado. Por lo tanto, la oreja del ratón sin pelo es un excelente modelo in vivo para estudiar las interacciones complejas durante la formación de trombos microvasculares, la evolución de trombos, y la trombólisis.

Resumen

complicaciones trombóticas de las enfermedades vasculares son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los países industrializados. Debido a las complejas interacciones entre los componentes sanguíneos celulares y no celulares durante la formación de trombos, estudios fiables de la fisiología y la patofisiología de la trombosis sólo pueden llevarse a cabo in vivo. Por lo tanto, este artículo presenta un modelo de oreja en ratones sin pelo y se centra en el análisis in vivo de la microcirculación, la formación de trombos, y la evolución de trombos. Mediante el uso de microscopía de fluorescencia intravital y la intravenosa (iv) la aplicación de los respectivos colorantes fluorescentes, un análisis repetitivo de la microcirculación en la aurícula fácilmente se puede realizar, sin la necesidad de la preparación quirúrgica. Además, este modelo puede ser adaptado para estudios in vivo de los diferentes temas, incluyendo la cicatrización de heridas, lesión por reperfusión, o angiogénesis. En resumen, la oreja de los ratones sin pelo es un modelo ideal para el en vivo estudio de la microcirculación de la piel en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas y para la evaluación de su reacción a diferentes tratamientos sistémicos o tópicos.

Introducción

El propósito del presente artículo es describir la técnica de la microscopía intravital aplicada a la aurícula del ratón sin pelo para la observación directa y el análisis de la microcirculación, la formación de trombos, y la evolución de trombos. Con una tasa de incidencia de 1 en 1000, trombosis venosa sigue siendo una causa común de morbilidad. Aunque el diagnóstico, estrategias de prevención y terapias se han desarrollado en los últimos años, un tercio de la trombosis venosa se manifiesta como una embolia pulmonar ^1. La trombosis arterial juega un papel crítico en las enfermedades cardiovasculares, que son la causa más común de muerte en los países industrializados. La trombosis arterial basado en la ruptura de las placas ateroscleróticas está involucrado en ataques cardiacos, infartos mesentéricas, y apoplejía. Cada cirugía expone estructuras subendoteliales a componentes de la sangre, cambia la dinámica de flujo de sangre, e inmoviliza el paciente. En la cirugía de endoprótesis de la extremidad inferior, órgano transplantation y trombosis cirugía de colgajo son causas frecuentes de complicaciones. trombosis microvascular en particular, con frecuencia provoca daños irreversibles, debido a la falta de síntomas clínicos. Del mismo modo, la trombosis microvascular juega una regla fundamental en varias enfermedades, incluyendo la púrpura trombótica trombocitopénica, sepsis, coagulación intravascular diseminada, síndrome antifosfolípido, y la insuficiencia venosa crónica, entre otros.

Varios de los nuevos medicamentos para la terapia y prevención de la trombosis se han desarrollado en los últimos años, pero los fármacos antiplaquetarios y anticoagulantes todavía tienen efectos secundarios, antagonistas de la falta, y cuentan con efectos de larga duración. Estas deficiencias conducen a problemas en la atención médica de emergencia. Por lo tanto, se necesita más investigación para descubrir los procesos complejos que se producen durante la trombosis, que difícilmente puede ser simulada in vitro.

El ratón sin pelo ^HR SKH1-Hr fue descubierta 1926 en un zoológico de Londres.Debido a un defecto genético en el cromosoma 14, el animal pierde su piel después del día postnatal 10. Esto hace que la aurícula bien vascularizado accesible para microscopía intravital de los vasos. El espesor medio de la oreja es de 300 m. Se compone de dos capas de la dermis, que están separados por el cartílago. En el lado dorsal convexa del cartílago, 3 haces vasculares entran en el lóbulo de la oreja. arcos vasculares apical y shunts basales conectan los tres haces. Las vénulas tienen diámetros comprendidos entre 200 micras (basal) y 10 m (apical). Capilares de malla fina rodean el cabello folículos vacíos ^2. La anatomía del ratón sin pelo ^HR SKH1-Hr hace que la aurícula un modelo potente y rentable para la investigación de la trombosis.

Protocolo

Todos los experimentos in vivo (7221.3-1-006 / 15) se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación alemana sobre protección de los animales y la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Recursos Animales de Laboratorio, Consejo Superior de Investigaciones Científicas).

1. Mantener general de los animales

1. Realice los experimentos con ratones ^hr SKH1-HR macho de 4 a 6 semanas. Utilizar animales con un peso entre 20 y 25 g.
2. Mantener a los animales en una instalación libre de patógenos y en condiciones estandarizadas de 24 a 26 ° C y alrededor de 60% de humedad relativa, con acceso constante a agua y alimento ad libitum.
3. Mantener hasta cinco animales macho en una jaula. Proporcionar ropa de cama y material de enriquecimiento durante el alojamiento de los animales para su bienestar.

2. Predisposición de los Animales

1. Pesar un ratón y cargar el fármaco respectivo (por ejemplo, el cannabinoide, 5 mg / kg de peso corporal (BW)) en una jeringa de insulina. Administrar el fármaco min 30 antes de la inducción del trombo.
2. Al mantener el cuello del ratón entre el pulgar y el dedo índice y la cola del ratón con el dedo meñique, estirar el animal e inyectar el fármaco por vía intraperitoneal (ip) en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen. Ponga el animal de nuevo en la jaula durante 15 min.
3. Preparar la anestesia con ketamina (90 mg / kg de peso corporal) y xilazina (25 mg / kg de peso corporal). 15 min antes de la inducción del trombo, anestesiar al ratón. Ponga el ratón en la jaula, tirar de la cola ligeramente, e inyectar el ip anestésicos con una jeringa de insulina.
4. Ponga el ratón de nuevo en la jaula hasta el inicio de la anestesia. Para verificar la anestesia suficiente, pellizcar la cola con unas pinzas.
5. Cargar 0,05 ml de dextrano descongelado isotiocianato de fluoresceína marcado con (FITC-dextrano; 5%, 150 kDa) en una jeringa de insulina. Mientras llenado de la jeringa, garantizar que no queden burbujas de aire, ya que incluso pequeñas intravenously (iv) las burbujas de aire administrados por la OMPI puede ser letal para el animal.
6. Coloque el ratón anestesiado en una placa de calentamiento en la posición boca abajo. Ajustar la placa de calentamiento a 37 ° C.
7. Ponga pomada ocular en la córnea del ratón. Desinfectar la piel y el uso de instrumentos estériles.
8. Cosa dos suturas de polipropileno 7/0 en el borde craneal y caudal de la oreja derecha. Coloque los puntos de sutura tan cerca del borde y como proximal a la base como sea posible (Figura 1B).
9. Desplazar el ratón a la posición dorsal. Fijar todas las patas a la plataforma acrylglass el uso de tiras adhesivas. Enganche una sutura bajo los dientes delanteros y la posición de la cabeza en la dorsiflexión pegando la sutura a la acrylglass con tiras adhesivas.
10. Translocate el animal sobre la plataforma bajo el estereomicroscopio operación. Utilice magnificación de 16X.

3. Preparación de la vena yugular y la inyección de FITC-dextrano izquierda

Nota: para micrófonoroscopy de la oreja derecha, preparar la vena yugular izquierda.

1. El uso de un bisturí, crear una incisión de 5 mm en la piel en el lado izquierdo del cuello en una dirección cráneo-caudal. Diseccionar el tejido subcutáneo con un micropinzas y micro tijeras. Cualquiera de los vasos de cruce se liga con poliéster 8/0 suturas o con electrocoagulación.
2. Liberar la vena de su adventicia usando micropinzas y micro tijeras sin tocar el recipiente.
3. Usar la jeringa de insulina preparada para la inyección del colorante fluorescente. agarrar con cuidado la pared del vaso con las micropinzas, sin perforar la vena. Penetran en la pared del vaso dilatado con la jeringa e inyectar iv FITC-dextrano.
4. Detener la hemorragia después de la retirada de la jeringa usando hisopos de algodón. Evitar la sangre y teñir la contaminación de la oreja.

4. Colocación de la oreja derecha de intravital microscopía de fluorescencia

1. Transferir el animal sobre la placa de calentamiento a una acrylglass construction con una ranura para la placa de calentamiento y un plano de 0,5 cm de alto para el posicionamiento del oído.
2. Fijar el animal cara hacia abajo en la placa de calentamiento mediante tiras adhesivas. Coloque el cartílago relativamente fuerte y convexa en la base de la oreja al lado de la 0,5 cm de alto avión para el oído (Figura 1B) de manera que la parte apical de la oreja puede colocarse plana en el avión.
3. Añadir una gota de temperatura ambiente 0,9% NaCl al plano acrylglass el fin de posicionar el oído. Coloque la oreja derecha, con las suturas preestablecidas en su cóncava lado ventral hacia abajo, sobre la gota de 0.9% de NaCl. El uso de hisopos de algodón, absorber la caída de NaCl y dejar que las fuerzas capilares se unen el plano oído a la acrylglass.
4. Cinta de las suturas para la acrylglass para fijar la posición de la oreja.
5. Añadir una gota de 0.9% NaCl temperatura ambiente a la cara dorsal convexa de la oreja. Con cuidado, poner un cubreobjetos (0,5 cm de diámetro) en la oreja sin comprimir los vasos basales entran ºe oreja. El uso de bastoncillos de algodón, eliminar la mayor cantidad posible de NaCl de debajo del cubreobjetos con el fin de minimizar la distancia entre el cubreobjetos y los vasos diana oído.

5. intravital microscopía de fluorescencia y el trombo inducción de la oreja derecha

1. Ajuste el microscopio de fluorescencia intravital para la visualización FITC-dextrano (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Utilice una lámpara de mercurio de 100 W-variable como una fuente de luz. Conectar una alta resolución, cámara CCD en blanco y negro a una grabadora de DVD.
2. Transferir el animal en la acrylglass que contiene la placa de calentamiento con el oído secuestrado fija a la mesa del microscopio de fluorescencia intravital.
3. El uso de 20 aumentos (20X / 0.95 abertura numérica) y la intensidad de luz del 20%, la búsqueda de un vaso venoso 50 - 60 micras de diámetro y con un flujo de sangre anterógrado de 400 a 600 m / s.
4. Añadir una gota de agua a temperatura ambiente a la cubreobjetos de inmersión en agua de la 63x magnification objetivo (63X / 0.95 abertura numérica). Use una jeringa con una cánula 1 mm de diámetro y colocar la gota en el objetivo del microscopio. Añadir agua suficiente para ponerse en contacto con el cubreobjetos y el objetivo con la gota de agua.
5. Inmediatamente después de la aplicación de la gota de agua, comenzar a grabar el recipiente durante 20 s con 20% de intensidad de la luz para la medición en línea de la corriente de diámetro y sangre.
6. Iniciar la inducción trombo 5 min después de la inyección de FITC-dextrano. Para este fin, elevar la intensidad de la luz a 100%.
7. Durante la inducción de trombos, cerrar la abertura del microscopio durante 2 s en un plazo de 30-s para comprobar el flujo de sangre. En caso de persistencia de flujo sanguíneo, abrir la abertura de nuevo. En el caso de flujo sanguíneo detenido, observar el recipiente durante 30 s.
   NOTA: El recipiente se clasifica como ocluida si el flujo se detiene durante 30 s o más o si la sangre fluye de forma retrógrada. Si el flujo sanguíneo ortógrada comienza de nuevo, abrir completamente la abertura y Contin ue la inducción de trombos hasta que se produce la oclusión del vaso como se describe anteriormente. Durante la inducción del trombo temprano, aseguran que los tiempos cuando la abertura se cerró para comprobar el flujo de la sangre son tan cortos como sea posible a fin de mantener casi continua epi-iluminación. Más tarde, durante el crecimiento de trombos, el recipiente se perfunde con el tinte fluorescente menos, por lo que se puede observar continuamente.
8. Seleccionar y ocluir vasos 5 por oído. Limitar el momento de la inducción del trombo bajo el microscopio para aproximadamente 1 h después de la inyección de FITC-dextrano.

6. Actividades de seguimiento

1. Realizar un cierre de la herida del cuello usando polipropileno transcutánea 6/0 suturas.
2. Durante la recuperación de la anestesia, poner el ratón de nuevo en la jaula y calentar el animal usando luz infrarroja.
3. La transferencia de los datos registrados de la grabadora DVD al software que permite la medición del diámetro de los vasos y la velocidad del flujo sanguíneo.

_TITLE "> 7. El examen de la oreja izquierda

1. Deje que el animal se recupere y eliminar todas inyectado FITC-dextrano durante 48 h.
2. Vuelva a ejecutar las etapas descritas anteriormente, esta vez la preparación de la vena yugular derecha y la oreja izquierda.

8. Tejido Asservation

1. Después de microscopía de fluorescencia intravital de la oreja izquierda, muestra de 0,5 ml de sangre a partir del plexo retrobulbar vena del ojo usando un capilar de vidrio. penetrar con cuidado el ángulo palpebral interior con los movimientos de rosca, hasta que la sangre venosa fluye a través del capilar. Recoger la sonda en un tubo de sangre ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
2. Después de tomar muestras de sangre, sacrificar el animal mediante la inyección de 500 mg / kg de ketamina bw en la vena caudal.
3. Contar las células de sangre usando un analizador de hematología para una evaluación cuantitativa de leucocitos, eritrocitos, plaquetas, hemoglobina y hematocrito.
4. Centrifugar la sangre EDTA restante a 2500 xg y temperatura ambiente durante 10 men. Pipeta y congelar el plasma sanguíneo para investigaciones posteriores.
5. Con unas tijeras, corte las aurículas y fijarlos en formaldehído al 4% para el examen histológico.

Resultados

Efectos del tratamiento sobre Cannabinoides trombogénesis

Tras la inyección de 0,05 ml de FITC-dextrano, la inducción de trombos fototóxico conduce a una lesión endotelial y la formación de un tapón de plaquetas parietal (Figuras 2 y 3). En el presente estudio, la inducción de trombos después de la inyección ip de los cannabinoides (5 mg / kg de peso corporal) o vehículo dio lugar a un...

Discusión

Hay varios pasos críticos para el éxito de la inducción de trombos en el lóbulo de la oreja de los ratones ^hr SKH1-HR. Para la solución de problemas, las respectivas etapas del protocolo se indican entre paréntesis.

condiciones de examen son ideales en los animales jóvenes a la edad de 4 - 6 semanas y con baja cornificación de la epidermis. En animales de mayor edad, la calidad de la visualización de los vasos es peor y menos comparable debido a la distancia mayor entre l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
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