Intravitalmikroskopie und Thrombusinduktion im Ohrläppchen eines Hairless Maus

Zusammenfassung

Das Ohr - Modell der haarlosen SKH1-Hr ^hr Maus ermöglicht intravitale Fluoreszenzmikroskopie der Mikrozirkulation und phototoxische Thrombus - Induktion ohne vorherige chirurgische Vorbereitung in dem untersuchten mikrovaskulären Bett. Daher ist das Ohr der nackten Maus eine ausgezeichnete In - vivo - Modell , um die komplexen Wechselwirkungen während mikrovaskuläre Thrombusbildung, Thrombus Evolution und Thrombolyse zu studieren.

Zusammenfassung

Thrombotischen Komplikationen von vaskulären Erkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in den Industrienationen. Aufgrund der komplexen Wechselwirkungen zwischen zellulären und nicht-zellulären Blutbestandteilen während der Thrombusbildung, können zuverlässige Studien der Physiologie und Pathophysiologie der Thrombose nur in vivo durchgeführt werden. Daher stellt dieser Artikel ein Ohr - Modell in Nacktmäusen und konzentriert sich auf die in vivo Analyse der Mikrozirkulation, Thrombusbildung und Thrombus Evolution. Durch die Verwendung von intravitale Fluoreszenzmikroskopie und die intravenösen (iv) der Anwendung der jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe, eine repetitive Analyse der Mikrozirkulation in der Ohrmuschel leicht durchgeführt werden kann, ohne die Notwendigkeit für chirurgische Vorbereitung. Darüber hinaus kann dieses Modell für die in - vivo - Studien der verschiedenen Emissionen angepasst werden, einschließlich Wundheilung, Reperfusionsschaden oder Angiogenese. Zusammenfassend ist das Ohr von Nacktmäusen ein ideales Modell für das in vivo Untersuchung der Mikrozirkulation der Haut in physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen und für die Bewertung der Reaktion auf verschiedene systemische oder topische Behandlungen.

Einleitung

Der Zweck der vorliegenden Art ist die Technik der Intravitalmikroskopie an die Ohrmuschel des haarlosen Maus für die direkte Beobachtung und Analyse der Mikrozirkulation, die Thrombusbildung und Thrombus Entwicklung angewandt zu beschreiben. Mit einer Inzidenz von 1 in 1000 ist venöse Thrombose immer noch eine häufige Ursache von Morbidität. Obwohl Diagnostik, Präventionsstrategien und Therapien in den letzten Jahren entwickelt wurden, ein Drittel der Venenthrombose manifestiert sich als eine Lungenembolie ^1. Die arterielle Thrombose spielt eine entscheidende Rolle bei kardiovaskulären Erkrankungen, die die häufigste Todesursache in den Industrienationen sind. Die arterielle Thrombose auf der Grundlage der Bruch von atherosklerotischen Plaques in Herzanfällen, Mesenterial- Infarkte beteiligt und Apoplexie. Jede Operation macht subendothelialen Strukturen auf Blutkomponenten, ändert sich die Dynamik des Blutflusses und lähmt den Patienten. In endoprothetischen Chirurgie der unteren Extremitäten, organ transplantation und Klappenchirurgie Thrombose sind häufige Ursachen von Komplikationen. Die mikrovaskuläre Thrombose insbesondere verursacht häufig irreversible Schäden, aufgrund des Fehlens von klinischen Symptomen. Ebenso spielt die mikrovaskuläre Thrombose eine entscheidende Regel in mehreren Krankheiten, einschließlich thrombotische thrombozytopenische Purpura, Sepsis, disseminierte intravaskuläre Koagulation, Antiphospholipid-Syndrom und chronische venöse Insuffizienz, unter anderem.

Mehrere neue Medikamente zur Therapie und Vorbeugung von Thrombosen wurden in den letzten Jahren entwickelt, aber eine gerinnungshemmende Medikamente und Antikoagulantien haben noch Nebenwirkungen, Mangel-Antagonisten, und verfügen über lange Dauer Effekte. Diese Mängel führen zu Problemen in der medizinischen Notversorgung. Somit wird mehr Forschung notwendig , um die komplexen Prozesse aufzudecken , die während Thrombose auftreten, die kaum in vitro simuliert werden kann.

Die haarlos SKH1-Hr ^hr - Maus wurde 1926 in einem Zoo in London entdeckt.Dies macht die gut durchbluteten Ohrmuschel zugänglich Intravitalmikroskopie der Gefäße aufgrund eines Gendefekts auf dem Chromosom 14, verliert das Tier das Fell nach dem 10. Tag nach der Geburt. Die durchschnittliche Dicke des Ohrs ist 300 um. Es besteht aus zwei Schichten aus Dermis, die durch Knorpel getrennt ist. Auf der konvexen dorsalen Seite des Knorpels, 3 Gefäßbündel geben Sie das Ohrläppchen. Apikalen und basalen vaskuläre Bögen Shunts verbinden die drei Bündel. Die Venolen haben Durchmesser zwischen 200 & mgr; m (basal) und 10 um (apical). Engmaschige Kapillaren umgeben das leere Haar ² Follikel. Die Anatomie der haarlos SKH1-Hr ^hr Maus macht die Ohrmuschel ein leistungsfähiges und kostengünstiges Modell für Thrombose Forschung.

Protokoll

Alle in - vivo - Experimente (7221.3-1-006 / 15) wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren und die NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortier Ressourcen, National Research Council) durchgeführt.

1. Allgemeine Haltung der Tiere

1. Führen Sie die Experimente mit männlichen SKH1-Hr ^hr - Mäusen im Alter von 4 bis 6 Wochen. Verwenden Tiere mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g.
2. Halten Sie die Tiere in einer keimfreien Anlage und unter standardisierten Bedingungen von 24 bis 26 ° C und etwa 60% relative Luftfeuchtigkeit, mit stetigem Zugang zu Wasser und Nahrung ad libitum.
3. Halten Sie bis zu fünf männlichen Tieren in einem Käfig. Geben Sie Bettwäsche und Anreicherung Material während des Gehäuses der Tiere für ihr Wohlbefinden.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Wiegen Sie eine Maus und laden das jeweilige Medikament (zB die Cannabinoid, 5 mg / kg Körpergewicht (BW)) in eine Insulinspritze. Administrieren das Medikament 30 Minuten vor der Thrombus-Induktion.
2. Durch das Halten des Halses der Maus zwischen dem Daumen und dem Zeigefinger und dem Schwanz der Maus mit dem kleinen Finger, dehnen das Tier und injizieren das Medikament intraperitoneal (ip) in den linken unteren Quadranten des Abdomens. Legen Sie das Tier zurück in den Käfig für 15 min.
3. Bereiten Anästhesie mit Ketamin (90 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin (25 mg / kg KG). 15 min vor der Thrombus-Induktion, betäuben die Maus. Setzen Sie die Maus in den Käfig, ziehen den Schwanz leicht und injizieren die Anästhetika ip mit einer Insulinspritze.
4. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig bis zum Beginn der Anästhesie. Um eine ausreichende Anästhesie zu überprüfen, klemmen den Schwanz mit einer Pinzette.
5. Last 0,05 ml abgetaut Fluoresceinisothiocyanat-markiertem Dextran (FITC-Dextran, 5%, 150 kDa) in eine Insulinspritze. Während die Spritze füllen, stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen bleiben, denn selbst kleine intravenously (iv) -administered Luftblasen können für das Tier tödlich sein.
6. Legen Sie die narkotisierten Maus auf einer Heizplatte in der bedruckten Seite nach unten Position. Stellen Sie die Heizplatte auf 37 ° C.
7. Setzt Augensalbe auf der Hornhaut der Maus. Desinfizieren Sie die Haut und verwenden sterile Instrumente.
8. Aufnähen zwei Naht aus Polypropylen 7/0 in die kraniale und kaudale Kante des rechten Ohres. Platzieren Sie die Stiche so nahe an den Rand und als proximal zu der Basis wie möglich sein (1B).
9. Verschieben Sie die Maus auf Rückenlage. Fix alle Beine der Acrylglas-Plattform Klebestreifen. Haken eine Naht unter den Vorderzähnen und die Position des Kopfes in Dorsalflexion durch Aufkleben der Naht an dem Acrylglas mit Klebestreifen.
10. Transloziert das Tier auf der Plattform unter dem Betrieb Stereo. Verwenden 16-facher Vergrößerung.

3. Herstellung der linke Jugularvene und die Injektion von FITC-Dextran

Hinweis: Für microscopy des rechten Ohrs, bereitet die linke Halsschlagader.

1. Unter Verwendung ein Skalpells, schafft einen 5-mm-Schnitt in der Haut auf der linken Seite des Halses in einem cranio-caudal. Seziert das subkutane Gewebe mit microforceps und Mikroschere. Entweder Ligat Kreuzung Gefäße mit Polyester 8/0 Nähten oder mit elektrischer Koagulation.
2. Befreien Sie die Vene von seiner adventitia mit microforceps und Mikroscheren, ohne den Behälter zu berühren.
3. Verwenden Sie die hergestellte Insulinspritze für die Injektion des fluoreszierenden Farbstoffs. greift sorgfältig den Gefßwand mit dem microforceps, ohne die Vene zu perforieren. Dringen die gedehnten Gefäßwand mit der Spritze aufgezogen und FITC-Dextran iv.
4. Stoppen Sie die Blutung nach der Spritze zurückzuziehen Wattestäbchen verwenden. Vermeiden Sie Blut und Kontamination des Ohres färben.

4. Positionierung des rechten Ohres für Intravitalfluoreszenzmikroskopie

1. Übertragen, um das Tier auf der Heizplatte auf eine Acrylglas construction mit einem Schlitz für die Heizplatte und eine 0,5 cm hohe Ebene für das Ohr zu positionieren.
2. Fix das Tier dem Gesicht nach unten auf der Heizplatte unter Verwendung von Klebebändern. Platzieren Sie die relativ starken und konvexe Knorpel an der Basis des Ohrs neben der 0,5 cm-Hochebene für das Ohr (1B) , so dass der apikale Teil des Ohres auf der Ebene flach angeordnet werden.
3. Einen Tropfen bei Raumtemperatur 0,9% NaCl auf die Acrylglas-Ebene, um das Ohr zu positionieren. Legen Sie das rechte Ohr mit dem vorbereiteten Nähte auf seiner konkaven ventralen Seite nach unten, auf dem Tropfen von 0,9% NaCl. Mit Wattestäbchen, absorbieren die Tropfen NaCl und lassen Kapillarkräfte das Ohr Ebene zur Acrylglas befestigen.
4. Kleben Sie die Nähte an das Acrylglas, die Position des Ohres zu beheben.
5. Einen Tropfen von 0,9% NaCl Raumtemperatur auf die konvexe Rückenseite des Ohres. Setzen Sie vorsichtig ein Deckglas (0,5 cm Durchmesser) auf dem Ohr, ohne dass die basalen Gefäße komprimiert Eingabe the Ohr. Mit Wattestäbchen entfernen, so viel wie möglich NaCl unter dem Deckglas, um den Abstand zwischen dem Deckglas und dem Ohrzielgefäß zu minimieren.

5. Intravitalfluoreszenzmikroskopie und Thrombusinduktion des rechten Ohrs

1. Stellen Sie das intravitale Fluoreszenzmikroskop für FITC-Dextran Visualisierung (450 bis 490 nm; FT: 510; LP: 520). Verwenden einer variablen 100-W-Quecksilberlampe als Lichtquelle. Schließen Sie einen hochauflösenden Schwarz-Weiß-CCD-Kamera mit einem DVD-Recorder.
2. Übertragen Sie das Tier auf dem Acrylglas der Heizplatte mit dem festen entführt Ohr an den Schreibtisch des intravital Fluoreszenzmikroskop enthält.
3. Verwendung von 20-facher Vergrößerung (20x / 0,95 numerische Apertur) und 20% der Lichtintensität, suchte nach einem venösen Gefäß 50 bis 60 & mgr; m im Durchmesser und mit einem anterograden Blutfluss von 400 bis 600 & mgr; m / s.
4. Einen Tropfen Raumtemperatur Wasser auf das Deck für Wasser Eintauchen des 63x magnification Objektiv (63X / 0.95 numerische Apertur). Verwenden, um eine Spritze mit einer 1-mm-Durchmesser-Kanüle und legen den Tropfen auf dem Objektiv des Mikroskops. In gerade genug Wasser, um das Deckglas und das Ziel mit dem Wassertropfen zu kontaktieren.
5. Unmittelbar nach dem Aufbringen des Wassertropfens, beginnen, für 20 s mit 20% der Lichtintensität für die Offline-Messung des Durchmessers und die Durchblutung der Behälter der Aufnahme.
6. Starten Sie Thrombusinduktion 5 min nach der Injektion von FITC-Dextran. Zu diesem Zweck erhöht die Lichtintensität auf 100%.
7. Während der Thrombus-Induktion, schließen die Apertur des Mikroskops für 2 s innerhalb eines Zeitraums von 30 s um den Blutfluss zu überprüfen. Im Falle der Blutfluß persistierenden, öffnen Sie das wieder Blende. Im Fall des Blutflusses gestoppt wird, beobachtet das Gefäß für 30 s.
   HINWEIS: Das Schiff klassifiziert wird als verschlossen, wenn die Strömung noch für 30 s steht oder mehr, oder wenn das Blut fließt retrograde. Wenn der orthograden Blutfluss wieder beginnt, öffnen Sie vollständig die Blende und Contin ue der Thrombus-Induktion bis auftritt Gefäßverschluss, wie oben beschrieben. Während der frühen Thrombusinduktion, sicherzustellen, dass die Zeiten, in denen die Öffnung geschlossen wurde um den Blutfluss zu prüfen, so kurz wie möglich sein, um fast kontinuierliche epi-Beleuchtung aufrechtzuerhalten. Später, während Thrombus Wachstum wird das Gefäß mit weniger Fluoreszenzfarbstoff perfundiert, so können sie kontinuierlich beobachtet werden.
8. Wählen und okkludieren 5 Schiffe pro Ohr. Begrenzen die Zeit der Thrombus-Induktion unter dem Mikroskop auf etwa 1 h nach der Injektion von FITC-Dextran.

6. Follow-up-Aktivitäten

1. Führen Sie einen Wundverschluss des Halses mit transkutanen Polypropylen 6/0 Nähten.
2. Während aus der Narkose, legen Sie die Maus wieder in den Käfig und erwärmen das Tier Infrarotlicht.
3. Übertragen Sie die aufgezeichneten Daten von der DVD-Recorder-Software ermöglicht die Messung des Durchmessers des Gefäßes und Geschwindigkeit des Blutflusses.

_title "> 7. Die Untersuchung des linken Ohres

1. Lassen Sie das Tier erholen und beseitigen alle injiziert FITC-Dextran für 48 Stunden.
2. Führen Sie erneut die oben beschriebenen Schritte, diesmal die rechte Halsvene und das linke Ohr vor.

8. Gewebe Asservierung

1. Nach dem intravitalen Fluoreszenzmikroskopie des linken Ohrs, Probe 0,5 ml Blut aus dem retrobulbären Venenplexus des Auges unter Verwendung einer Glaskapillare. Sorgfältig durchdringt die inneren palpebral Winkel mit Einschrauben Bewegungen, bis venöses Blut durch die Kapillare fließt. Sammeln Sie die Sonde in einer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Blutröhrchen.
2. Nach der Blutentnahme, opfert das Tier durch Injektion von 500 mg / kg Körpergewicht Ketamin in die Schwanzvene.
3. Zählen der Blutzellen mit einem Hämatologie-Analysator für eine quantitative Bewertung von Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten, Hämoglobin und Hämatokrit.
4. Zentrifugieren der restlichen EDTA-Blut bei 2500 × g und Raumtemperatur für 10 min. Pipette und friert das Blutplasma für weitere Untersuchungen.
5. Mit einer Schere, schneiden Sie die Vorhöfe und befestigen Sie sie in 4% Formaldehyd für die histologische Untersuchung.

Ergebnisse

Auswirkungen der Cannabinoid-Behandlung auf Thrombogenese

Bei der Injektion von 0,05 ml von FITC-Dextran, phototoxischer Thrombus führt zu einer Induktion endothelialer Läsion und die Bildung eines parietalen Blutplättchenpfropfen (2 und 3). In der vorliegenden Studie, Thrombus - Induktion nach der ip - Injektion von Cannabinoiden (5 mg / kg Körpergewicht) oder Trägern führte zu einem throm...

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte für die erfolgreiche Thrombusinduktion im Ohrläppchen von SKH1-Hr ^hr - Mäusen. Zur Fehlersuche werden die jeweiligen Schritte des Protokolls in Klammern angegeben.

Prüfungsbedingungen sind ideal bei jungen Tieren im Alter von 4 - 6 Wochen und mit geringer Verhornung der Epidermis. Bei älteren Tieren, ist die Qualität der Visualisierung des Gefäßes schlechter und weniger vergleichbar aufgrund des höheren Abstand zwischen der Hautoberfläch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
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