Microscopie intravitale et thrombus induction dans le lobe de l'oreille d'une souris sans poils

Résumé

Le modèle de l' oreille de la souris sans poils ^SKH1-Hr permet la microscopie à fluorescence intravitale de la microcirculation et phototoxique induction de thrombus sans préparation chirurgicale préalable dans le lit microvasculaire examiné. Par conséquent, l'oreille de la souris sans poil est un excellent modèle in vivo pour étudier les interactions complexes pendant la formation de thrombus microvasculaire, l' évolution de thrombus et thrombolyse.

Résumé

complications thrombotiques des maladies vasculaires sont une des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. En raison des interactions complexes entre les composants sanguins cellulaires et non cellulaires pendant la formation de thrombus, des études fiables de la physiologie et physiopathologie de la thrombose ne peut être effectuée in vivo. Par conséquent, cet article présente un modèle de l' oreille chez les souris sans poil et se concentre sur l'analyse in vivo de la microcirculation, la formation de thrombus et de l' évolution de thrombus. En utilisant la microscopie à fluorescence intravitale et l'application par voie intraveineuse (iv) des colorants fluorescents respectifs, une analyse répétitive de la microcirculation dans l'oreillette peut facilement être réalisé sans la nécessité d'une préparation chirurgicale. En outre, ce modèle peut être adapté pour des études in vivo de différentes questions, y compris la cicatrisation des plaies, des lésions de reperfusion, ou angiogenèse. En résumé, l'oreille des souris sans poils est un modèle idéal pour la viv eno Etude de la microcirculation cutanée dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques et pour l'évaluation de sa réaction à différents traitements systémiques ou topiques.

Introduction

Le but de l'article est de décrire la technique de microscopie intravitale appliquée à l'auricule de la souris sans poils pour l'observation directe et l'analyse de la microcirculation, la formation de thrombus et de l'évolution de thrombus. Avec un taux d'incidence de 1 sur 1000, la thrombose veineuse est encore une cause fréquente de morbidité. Bien que le diagnostic, les stratégies de prévention et les thérapies ont été développées ces dernières années, un tiers de la thrombose veineuse se manifeste par une embolie pulmonaire ^1. La thrombose artérielle joue un rôle essentiel dans les maladies cardio-vasculaires, qui sont la cause la plus fréquente de décès dans les pays industrialisés. thromboses artérielles basée sur la rupture des plaques d'athérosclérose est impliqué dans les crises cardiaques, infarctus mésentérique, et apoplexie. Chaque chirurgie expose les structures sous-endothéliales aux composants sanguins, modifie la dynamique de la circulation sanguine, et immobilise le patient. En chirurgie endoprothétique du membre inférieur, organe transplantation et thrombose chirurgie du lambeau sont des causes fréquentes de complications. thrombose microvasculaire en particulier provoque souvent des dommages irréversibles, en raison de l'absence de symptômes cliniques. De même, la thrombose microvasculaire joue une règle essentielle dans plusieurs maladies, y compris purpura thrombotique thrombocytopénique, la septicémie, la coagulation intravasculaire disséminée, syndrome des antiphospholipides, et l'insuffisance veineuse chronique, entre autres.

Plusieurs nouveaux médicaments pour le traitement et la prévention de la thrombose ont été développées ces dernières années, mais les médicaments antiplaquettaires et les anticoagulants encore avoir des effets secondaires, les antagonistes manquent, et présentent des effets de longue durée. Ces carences entraînent des problèmes dans les soins médicaux d'urgence. Ainsi, il faut plus de recherches pour découvrir les processus complexes qui se produisent pendant la thrombose, qui peut difficilement être simulé in vitro.

La souris sans poils ^SKH1-Hr a été découvert 1926 dans un zoo à Londres.En raison d'un défaut de gène sur le chromosome 14, l'animal perd sa fourrure après jour post-natal 10. Cela rend le bien vascularisé auricule accessible à la microscopie intravitale des vaisseaux. L'épaisseur moyenne de l'oreille est de 300 um. Il se compose de deux couches de derme, qui sont séparés par du cartilage. Sur la face dorsale convexe du cartilage, 3 faisceaux vasculaires entrent dans le lobe de l'oreille. arcs vasculaires apical et shunts de base relient les trois faisceaux. Les veinules ont des diamètres compris entre 200 pm (de base) et 10 um (apical). Capillaires gros maillés entourent les follicules pileux vide ^2. L'anatomie de la souris sans poils ^SKH1-Hr fait l'auricule un modèle puissant et rentable pour la recherche sur la thrombose.

Protocole

Toutes les expériences in vivo (7221.3-1-006 / 15) ont été menées conformément à la législation allemande sur la protection des animaux et le NIH Guide pour les soins et l' utilisation des animaux de laboratoire (Institut des ressources animales de laboratoire, Conseil national de recherches).

1. Tenue générale des animaux

1. Effectuez les expériences avec des souris mâles ^hr SKH1-HR de 4 à 6 semaines. Utiliser des animaux d'un poids compris entre 20 et 25 g.
2. Gardez les animaux dans un établissement exempt d' agents pathogènes et dans des conditions normalisées de 24 à 26 ° C et environ 60% d' humidité relative, avec un accès régulier à l' eau et la nourriture ad libitum.
3. Gardez jusqu'à cinq animaux mâles dans une cage. Fournir la literie et du matériel d'enrichissement pendant le logement des animaux pour leur bien-être.

2. Prédisposition des animaux

1. Peser une souris et de charger le médicament respectif (par exemple, le cannabinoïde, 5 mg / kg de poids corporel (pc)) dans une seringue à insuline. Administrer le médicament 30 minutes avant l'induction de thrombus.
2. En tenant le goulot de la souris entre le pouce et l'index et la queue de la souris avec le petit doigt, étirer l'animal et injecter le médicament par voie intraperitoneale (ip) dans le quadrant inférieur gauche de l'abdomen. Remettre en place l'animal dans la cage pendant 15 min.
3. Préparer l'anesthésie à la kétamine (90 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (25 mg / kg de poids corporel). 15 min avant l'induction de thrombus, anesthésier la souris. Placez la souris dans la cage, tirer la queue légèrement et injecter l'ip anesthésiques avec une seringue d'insuline.
4. Placez la souris de nouveau dans la cage jusqu'à l'apparition de l'anesthésie. Pour vérifier l'anesthésie suffisante, pincer la queue avec des pinces.
5. Charge 0,05 ml de dextrane marqué à la fluorescéine isothiocyanate-décongelé (FITC-dextran, 5%, 150 kDa) dans une seringue à insuline. Tout en remplissant la seringue, assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air, parce que même petite intravenously (iv) des bulles d'air peuvent être administrés par létale pour l'animal.
6. Placez la souris sur anesthésié une plaque chauffante en position face cachée. Ajuster la plaque chauffante à 37 ° C.
7. Mettez la pommade oculaire sur la cornée de la souris. Désinfectez la peau et utiliser des instruments stériles.
8. Point deux sutures de polypropylène 7/0 dans le bord crânienne et caudale de l'oreille droite. Placez les points le plus près du bord et que des proximale à la base que possible (figure 1B).
9. Déplacer la souris sur la position dorsale. Fixer les jambes à la plate-forme de verre acrylique à l'aide de bandes adhésives. Accrocher un fil de suture dans les dents de devant et de positionner la tête en dorsiflexion en collant le fil de suture au verre acrylique avec des bandes adhésives.
10. L'animal sur la translocation de la plate-forme sous la loupe binoculaire de fonctionnement. Utilisez un grossissement 16X.

3. Préparation de la gauche Veine jugulaire et injection de FITC-Dextran

Remarque: Pour microroscopy de l'oreille droite, préparer la veine jugulaire gauche.

1. En utilisant un scalpel, créer une incision de 5 mm dans la peau sur le côté gauche du cou dans une direction cranio-caudale. Disséquer le tissu sous-cutané avec microforceps et microciseaux. Soit les navires de passage ligaturer avec des sutures polyester 8/0 ou avec l'électrocoagulation.
2. Libérez la veine de son adventice en utilisant microforceps et microciseaux sans toucher le navire.
3. Utiliser la seringue d'insuline préparée pour l'injection du colorant fluorescent. saisir délicatement la paroi du vaisseau avec les microforceps, sans perforer la veine. Pénétrer la paroi du vaisseau dilaté avec la seringue et injecter iv FITC-dextran.
4. Arrêter le saignement après avoir retiré la seringue à l'aide de cotons-tiges. Évitez le sang et le colorant contamination de l'oreille.

4. Positionnement de l'oreille droite pour Intravitale Microscopie Fluorescence

1. Transférer l'animal sur la plaque chauffante à un verre acrylique construction avec une fente pour la plaque chauffante et un plan de 0,5 cm de haut pour le positionnement de l'oreille.
2. Fixer le visage animal vers le bas sur la plaque de chauffage à l'aide de bandes adhésives. Placez le cartilage relativement forte et convexe à la base de l'oreille à côté du plan de 0,5 cm de haut pour l'oreille (Figure 1B) de sorte que la partie apicale de l'oreille peut être positionné à plat sur le plan.
3. Ajouter une goutte de la température ambiante de 0,9% de NaCl par rapport au plan de verre acrylique afin de positionner l'oreille. Placer l'oreille droite, avec les sutures préétablis sur sa face ventrale concave vers le bas, sur la goutte de NaCl à 0,9%. En utilisant des tampons de coton, d'absorber la baisse de NaCl et de laisser les forces capillaires fixent le plan de l'oreille au verre acrylique.
4. Collez les sutures du verre acrylique pour fixer la position de l'oreille.
5. Ajouter une goutte de 0,9% de NaCl température ambiante à la face dorsale convexe de l'oreille. Soigneusement mettre une lamelle couvre-objet (0,5 cm de diamètre) sur l'oreille sans comprimer les vaisseaux de base entrant the oreille. En utilisant des cotons-tiges, enlever le plus NaCl possible sous la lamelle afin de minimiser la distance entre la lamelle et les vaisseaux cibles de l'oreille.

5. Microscopie intravitale fluorescence et thrombus induction de l'oreille droite

1. Réglez le microscope à fluorescence intravitale pour la visualisation FITC-dextran (450-490 nm; FT: 510; LP: 520). Utiliser une variable lampe à mercure de 100 W comme source de lumière. Connectez une haute résolution, CCD noir et blanc appareil photo à un graveur de DVD.
2. Transfert de l'animal sur le contenant la plaque verre acrylique de chauffage à l'oreille enlevé fixé au bureau du microscope à fluorescence intravitale.
3. En utilisant un grossissement de 20X (20X / 0,95 d'ouverture numérique) et 20% de l'intensité lumineuse, la recherche d'un vaisseau veineux 50 - 60 um de diamètre et avec un flux sanguin antérograde de 400-600 um / s.
4. Ajouter une goutte d'eau à la température ambiante à l'immersion pour de lamelle couvre eau du 63x magnificatioObjectif n (ouverture numérique 63X / 0,95). Utiliser une seringue avec une canule d'un diamètre de 1 mm et placer la goutte sur l'objectif du microscope. Ajouter de l'eau juste assez pour contacter la lamelle et l'objectif avec la goutte d'eau.
5. Immédiatement après l'application de la goutte d'eau, commencer l'enregistrement de la cuve pendant 20 s avec 20% de l'intensité lumineuse pour la mesure hors ligne du diamètre et du débit sanguin.
6. Lancer thrombus induction 5 min après l'injection de FITC-dextran. A cet effet, augmenter l'intensité lumineuse à 100%.
7. Au cours de l'induction de thrombus, fermer l'ouverture du microscope pendant 2 s dans un délai de 30 s pour vérifier le flux sanguin. En cas de persistance de la circulation sanguine, ouvrir l'ouverture de nouveau. En cas de flux sanguin arrêté, observer le bateau pendant 30 s.
   NOTE: Le navire est classé comme occlus si le débit est toujours debout pendant 30 secondes ou plus ou si le sang coule par voie rétrograde. Si le flux sanguin orthograde commence à nouveau, ouvrir complètement l'ouverture et Contin ue l'induction de thrombus jusqu'à ce que l'occlusion du vaisseau se produit comme décrit ci-dessus. Au début de l'induction de thrombus, assurez-vous que le temps où l'ouverture a été fermée pour vérifier le flux sanguin sont aussi courts que possible afin de maintenir à éclairage presque continue. Plus tard, pendant la croissance de thrombus, le navire est perfusé avec moins de colorant fluorescent, de sorte qu'il peut être observé de manière continue.
8. Sélectionner et 5 occlure navires par oreille. Limiter le temps d'induction de thrombus sous le microscope à environ 1 h après l'injection de FITC-dextran.

6. Activités de suivi

1. Effectuer une fermeture de la plaie du cou à l'aide polypropylène 6/0 transcutanée sutures.
2. Lors de la récupération de l'anesthésie, mettez la souris de nouveau dans la cage et réchauffer l'animal en utilisant la lumière infrarouge.
3. Transférer les données enregistrées à partir de l'enregistreur de DVD au logiciel permettant la mesure du diamètre des vaisseaux et la vitesse du flux sanguin.

_title "> 7. L'examen de l'oreille gauche

1. Laissez l'animal récupérer et éliminer toutes les FITC-dextran injecté pendant 48 h.
2. Les étapes réexécuter décrites ci-dessus, cette fois la préparation de la veine jugulaire droite et l'oreille gauche.

8. Tissu Asservation

1. Après la microscopie à fluorescence intravitale de l'oreille gauche, échantillon de 0,5 ml de sang du plexus veineux rétrobulbaire de l'œil à l'aide d'un capillaire en verre. pénétrer soigneusement l'angle palpébral interne avec des mouvements de vissage, jusqu'à ce que du sang veineux à travers le capillaire. Recueillir la sonde dans un tube de sang acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
2. Après le prélèvement de sang, le sacrifice de l'animal par l'injection de 500 mg / kg de poids corporel de kétamine dans la veine de la queue.
3. Compter les cellules sanguines en utilisant un analyseur d'hématologie pour une évaluation quantitative des leucocytes, des érythrocytes, des thrombocytes, l'hémoglobine et l'hématocrite.
4. Centrifuger le restant de sang EDTA à 2500 xg et à température ambiante pendant 10 mdans. Pipette et congeler le plasma sanguin pour d'autres investigations.
5. Avec des ciseaux, coupez les oreillettes et les fixer dans 4% de formaldéhyde pour un examen histologique.

Résultats

Effets du traitement cannabinoïdes sur thrombogenèse

Lors de l' injection de 0,05 ml de FITC-dextran, l' induction phototoxique de thrombus conduit à une lésion endothéliale et la formation d'un bouchon de plaquettes pariétal (figures 2 et 3). Dans la présente étude, l' induction d' un thrombus après l'injection ip de cannabinoïdes (5 mg / kg de poids corporel) o...

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques pour l'induction de thrombus réussie dans le lobe de l' oreille de souris ^SKH1-Hr. Pour le dépannage, les étapes respectives du protocole sont indiqués entre parenthèses.

conditions d'examen sont idéales chez les jeunes animaux à l'âge de 4 - 6 semaines et avec une faible kératinisation de l'épiderme. Chez les animaux plus âgés, la qualité de la visualisation des vaisseaux est pire et moins comparables en raison d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
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