מיקרוסקופית Intravital ו אינדוקציה פקיק ב התנוך של עכבר חסר שיער

Summary

המודל האוזן של העכבר SKH1-HR ^HR שיער מאפשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital מיקרו מחזורי ואינדוקציה פקיק phototoxic בלי הכנה כירורגית מוקדמת במיטה בחן כלי הדם. לכן, האוזן של העכבר ללא שיער היא מעולה במודל vivo ללמוד את יחסי הגומלין המורכבים במהלך היווצרות פקיק כלי דם, התפתחות פקיק, ו thrombolysis.

Abstract

סיבוכים טרומבוטיים של מחלות כלי דם הם גורם מוביל אחד לתחלואה ולתמותה במדינות מתועשות. בשל יחסי הגומלין המורכבים בין מרכיבי דם הסלולר בלתי תאיים במהלך היווצרות פקיק, מחקרים אמינים של הפיסיולוגיה והפתופיזיולוגיה של פקק יכולים להתבצע רק in vivo. לכן, במאמר זה מציג מודל האוזן בעכברים חסרי שיער ומתמקדת in vivo ניתוח מיקרו מחזורי, היווצרות קריש דם, והאבולוציה פקיק. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital ואת תוך הוורידים (iv) היישום של צבעי ניאון בהתאמה, ניתוח חוזר של מייקרו ב האפרכסת יכול להתבצע בקלות, ללא צורך בהכנה כירורגי. יתר על כן, המודל הזה ניתן להתאים ללימודי in vivo של נושאים שונים, כולל ריפוי פצעים, פגיעה reperfusion, או אנגיוגנזה. לסיכום, האוזן של עכברים חסרי שיער הוא מודל אידיאלי עבור ב vivמחקר o מייקרו מחזור עור בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological ועבור ההערכה של התגובה שלה לטיפולים מערכתיים או אקטואליים שונים.

Introduction

מטרת המאמר הנוכחי היא לתאר את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital להחיל את אפרכסת עכבר ללא שיער עבור תצפית ישירה וניתוח מיקרו מחזורי, היווצרות קריש דם, והאבולוציה פקיק. עם שיעור ההיארעות של 1 ב 1000, פקקת ורידים היא עדיין גורם שכיח לתחלואה. למרות אבחון, אסטרטגיות מניעות, טיפולים פותחו בשנים האחרונות, שליש פקק ורידים מבטאים כמו תסחיף ריאתי ^1. פקק עורקים משחק תפקיד קריטי מחלות לב וכלי דם, אשר הם הגורם השכיח ביותר למוות במדינות תעשייתיות. פקקת עורקים מבוסס על קרע של פלאק טרשת עורקים מעורב התקפי לב, אוטם mesenteric, חרון וחמה. כל ניתוח חושף מבני subendothelial לרכיבי דם, משנה את הדינמיקה של זרימת דם, ומשתק את החולה. בניתוח endoprosthetic של הגפיים התחתונות, לא איברransplantation ו פקק דש ניתוח הם גורמים שכיחים של סיבוכים. פקקת כלי הדם בפרט לעיתים קרובות גורם לנזק בלתי הפיך, בשל היעדר סימפטומים קליניים. כמו כן, פקקת כלי הדם ממלא שלטון מכריע בכמה מחלות, כולל ארגמנת תרומבוציטופנית טרומבוטיים, אלח דם, קרישה תוך-כלית מפושטת, תסמונת antiphospholipid, ו-ספיקה ורידית כרונית, בין היתר.

תרופות חדשות אחדות עבור הטיפול והמניעה של פקק פותחו בשנים האחרונות, אבל טסיות תרופות נגד קרישת דם עדיין יש תופעות לוואי, אנטגוניסטים חוסר, וכוללות תופעות משך זמן. ליקויים אלה להוביל לבעיות בטיפול רפואי דחוף. לפיכך, יש צורך במחקר נוסף כדי לחשוף את התהליכים המורכבים המתרחשים במהלך פקק, אשר בקושי ניתן לדמות במבחנה.

עכבר ^hr SKH1-HR השיער התגלה 1926 בגן חיות בלונדון.בשל פגם גנטי בכרומוזום 14, החיה מאבדת את הפרווה שלה אחרי יום הלידה 10. זה הופך את מיקרוסקופיה היטב vascularized אפרכסת נגישה intravital של כלי. העובי הממוצע של האוזן הוא 300 מיקרומטר. הוא מורכב משתי שכבות של הדרמיס, אשר מופרדים על ידי סחוס. בצד הגב הקמור של הסחוס, 3 חבילות וסקולרית להיכנס התנוך. קשתות וסקולריים Apical ו shunts הבסיס לחיבור שלושת חבילות. Venules יש בקטרים ​​בין 200 מיקרומטר (basal) ו 10 מיקרומטר (פסגה). נימים-מרושתים לסגור המקיפים את השיער הריק זקיקי ^2. האנטומיה של העכבר ^hr SKH1-HR שיער הופכת את אפרכסת מודל עוצמה וחסכוני למחקר פקקת.

Protocol

כל הניסויים vivo ב (7221.3-1-006 / 15) נערכו בהתאם לחקיקה גרמנית על הגנה על בעלי חיים מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (Institute of Resources בחיות מעבדה, המועצה הלאומית למחקר).

שמירת 1. כללי של בעלי החיים

1. בצע את הניסויים עם עכברים SKH1-HR ^HR זכר בגילאי 4 עד 6 שבועות. משתמשים בבעלי חיים עם משקל בין 20 ו 25 גרם.
2. שמור את החיות במתקן הפתוגן נטול בתנאים סטנדרטיים של 24 עד 26 מעלות צלזיוס וכ לח 60% ביחס, עם גישה קבועה כדי כרצונך מים ומזון.
3. שמור עד חמש חיות זכר בכלוב אחד. ספקו מצעים וחומר העשרה במהלך הדיור של בעלי חיים ורווחתם.

2. סידור מכוון של בעלי החיים

1. לשקול עכבר וטען את התרופה המתאימה (למשל, קנבינואידים, 5 מ 'משקל גוף g / kg (BW)) לתוך מזרק אינסולין. נהל דק תרופת 30 לפני גיוס פקיק.
2. על ידי החזקת הצוואר של העכבר בין האגודל לבין האצבע המורה ואת הזנב של העכבר עם האצבע הקטנה, למתוח את החיה ואת להזריק את התרופה intraperitoneally (IP) לתוך ברבע השמאלי התחתון של הבטן. שים את החיה בחזרה לתוך הכלוב עבור 15 דקות.
3. הכן הרדמה עם קטמין (90 מ"ג / ק"ג BW) ו xylazine (25 מ"ג / ק"ג BW). 15 דקות לפני אינדוקציה פקיק, להרדים את העכבר. שים את העכבר בכלוב, למשוך את הזנב מעט, ולהזריק את ip הרדמה עם מזרק אינסולין.
4. שים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב עד תחילת ההרדמה. כדי לאמת הרדמה מספיק, לצבוט את הזנב עם מלקחיים.
5. טען 0.05 מ"ל של dextran isothiocyanate שכותרתו והעמסת מופשר (FITC-dextran; 5%, 150 KDA) לתוך מזרק אינסולין. תוך מילוי המזרק, להבטיח כי אין בועות אוויר להישאר, כי intravenousl הקטנה אפילוy (iv) בועות אוויר -administered יכול להיות קטלני עבור החיה.
6. מניחים את העכבר הרדים על צלחת חימום בעמדה כלפי מטה. התאם את צלחת חימום עד 37 מעלות צלזיוס.
7. שם משחת עיניים על הקרנית של העכבר. לחטא את העור ולהשתמש בכלים סטריליים.
8. Stitch שני תפרים של פוליפרופילן 7/0 לתוך קצה הגולגולת ואת הזנב של האוזן הימנית. מניח את התפרים קרובים לקצה וכפי הפרוקסימלי לבסיס ככל האפשר (1B איור).
9. העבר את העכבר למצב הגבי. לתקן את כל הרגליים לפלטפורמת acrylglass באמצעות רצועות דבקות. הוק תפר תחת השיניים הקדמיות ולמקם את הראש ב dorsiflexion ידי דבק תפר את acrylglass עם רצועות דבקות.
10. Translocate חיה על הפלטפורמה תחת סטראו הפעולה. השתמש גדלת 16X.

3. הכנת וריד הצוואר שמאל הזרקת FITC-dextran

הערה: מיקרופוןroscopy של האוזן הימנית, להכין את וריד הצוואר השמאלי.

1. באמצעות אזמל, ליצור חתך 5 מ"מ בעור בצד השמאלי של הצוואר לכיוון סקראל הזנב. לנתח את הרקמה התת עורית עם microforceps ו microscissors. כך או כלי למעבר ולקשור עם התפרים פוליאסטר 8/0 או עם electrocoagulation.
2. שחרר את הווריד מן adventitia שלה באמצעות microforceps ו microscissors בלי לגעת הספינה.
3. השתמש מזרק אינסולין מוכן להזרקה של צבע פלואורסצנטי. בזהירות לתפוס את הקיר כלי עם microforceps, ללא ניקוב הווריד. לחדור את דופן כלי נפוחה עם המזרק להזריק iv FITC-dextran.
4. לעצור את הדימום לאחר משיכת מזרק באמצעות צמר גפן. הימנע דם לצבוע זיהום של האוזן.

4. מיצוב של האוזן הימנית עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital

1. מעבירים את החיה על צלחת חימום ל C acrylglassonstruction עם חריץ עבור צלחת חימום מטוס 0.5 סנטימטר גבוה עבור מיצוב לאוזן.
2. תקן את פן חיה מטה על צלחת החימום באמצעות רצועות דבקות. מניח את הסחוס החזק קמור יחסית בבסיס האוזן ליד המטוס 0.5 סנטימטר הגבוה עבור האוזן (האיור 1B) כך שחלק הפסגה של האוזן ניתן למקם שטוח על המטוס.
3. להוסיף טיפה אחת של-בטמפרטורת החדר 0.9% NaCl למטוס acrylglass כדי למקם את האוזן. מניח את האוזן הימנית, עם התפרים המוסכמים על צד הגחון הקעור שלה פונים כלפי מטה, על הירידה של 0.9% NaCl. באמצעות צמר גפן, לספוג ירידה של NaCl ולתת לכוחות נימי לצרף את המטוס האוזן אל acrylglass.
4. קלט את התפרים אל acrylglass כדי לתקן את העמדה של האוזן.
5. להוסיף טיפה אחת של NaCl הטמפרטורה 0.9% מקום בצד הגבי הקמור של האוזן. בזהירות לשים coverslip אחד (0.5 ס"מ קוטר) על האוזן מבלי לדחוס כלי הבסיס הזנת האוזן דואר. באמצעות צמר גפן, להסיר NaCl ככל האפשר מתחת coverslip כדי למזער את המרחק בין coverslip וכלי יעד אוזן.

5. מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital ו פקיק אינדוקציה של האוזן הימנית

1. התאם את מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital עבור להדמיה FITC-dextran (450 - 490 ננומטר; FT: 510; LP: 520). השתמש מנורת כספית משתנה 100-W כמקור אור. חבר מצלמה CCD ברזולוציה גבוהה, בשחור-לבן כדי צורב DVD.
2. מעבירים את החיה על acrylglass המכיל את צלחת חימום עם האוזן נחטף קבוע לדלפק של מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital.
3. באמצעות גדלת 20X (20X / צמצם מספרי 0.95) ו 20% עוצמת אור, לחפש כלי ורידים 50 - 60 מיקרומטר בקוטר עם זרימת דם האנטרוגרד של 400 - 600 מיקרומטר / s.
4. להוסיף טיפה אחת של מים בטמפרטורת החדר כדי coverslip עבור טבילה במים של 63x magnificatioמטרת n (63X / 0.95 צמצם מספרי). השתמש במזרק עם צינורית בקוטר 1 מ"מ ומניחים את הירידה על המטרה של מיקרוסקופ. להוסיף מספיק מים כדי לפנות coverslip ואת המטרה עם טיפת מים.
5. מייד לאחר היישום של טיפת המים, להתחיל להקליט את הכלי עבור 20 s עם 20% עוצמת אור עבור המדידה המחוברת של הזרימה בקוטר ודם.
6. התחל אינדוקציה פקיק 5 דקות לאחר הזרקה של-dextran FITC. לשם כך, להעלות את עוצמת האור עד 100%.
7. במהלך אינדוקצית פקיק, לסגור את הצמצם של מיקרוסקופ עבור 2 ימים בתוך תקופה של 30-ים כדי לבדוק את זרימת הדם. במקרה של התמדת זרימת דם, לפתוח את הצמצם שוב. במקרה של זרימת דם פסיק, לבחון את הכלי עבור 30 s.
   הערה: הכלי מסווג האפיל אם הזרימה עומדת מלכה עבור 30 s או יותר או אם הדם זורם retrogradely. אם זרימת הדם orthograde מתחיל שוב, לגמרי לפתוח את הצמצם ואת Contin UE אינדוקציה פקיק עד חסימת כלי מתרחשת כפי שתואר לעיל. במהלך אינדוקציה פקיק מוקדם, להבטיח כי פעמים כאשר הצמצם היה סגור כדי לבדוק את זרימת הדם הם קצרים ככל האפשר על מנת לשמור כמעט EPI-תאורה רציפה. מאוחר יותר, במהלך צמיחת פקיק, הספינה perfused עם צבע פלואורסצנטי פחות, אז זה יכול להיות שנצפה ברציפות.
8. בחר לחסום 5 ספינות לכל אוזן. הגבל את הזמן של אינדוקציה פקיק תחת מיקרוסקופ כ 1 שעות לאחר הזרקה של-dextran FITC.

6. פעילויות המשך

1. בצע סגירת הפצע של הצוואר באמצעות פוליפרופילן transcutaneous 6/0 תפרים.
2. במהלך ההתאוששות מההרדמה, לשים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב ולחמם את החיה באמצעות אור אינפרא אדום.
3. מעבירים את הנתונים שנרשמו מן מקליט DVD לתוכנה המאפשר מדידה של קוטר כלי ומהירות זרימת הדם.

_title "> 7. בחינת האוזן השמאלית

1. בואו החיה להתאושש ולחסל מוזרק כל FITC-dextran עבור 48 h.
2. הרץ שוב את השלבים המתוארים לעיל, והפעם הכנת וריד תקין הצוואר ואת האוזן השמאלית.

8. רקמות Asservation

1. לאחר מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital של האוזן השמאלית, מדגם 0.5 מ"ל של דם מן מקלעת וריד retrobulbar של העין באמצעות נימי זכוכית. בזהירות לחדור זווית palpebral הפנימית עם תנועות דופקות, עד דם ורידים זורם דרך הנימים. אסוף את החללית בחומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) צינור דם.
2. לאחר לקיחת דמים, להקריב את החיה על ידי הזרקת 500 מ"ג / ק"ג BW קטמין לווריד הזנב.
3. ספירת תאי הדם באמצעות נתח המטולוגיה עבור הערכה כמותית של לויקוציטים, אריתרוציטים, טרומבוציטים, המוגלובין, המטוקריט ו.
4. צנטריפוגה דם EDTA הנותרים 2500 טמפרטורת XG ואת מקום 10 מ 'ב. פיפטה להקפיא את הפלזמה בדם לחקירות נוספות.
5. בעזרת מספריים, לחתוך את auricles ולתקן אותם בפורמלין 4% עבור בדיקה היסטולוגית.

תוצאות

ההשפעות של טיפול הקנבינואידיים Thrombogenesis

לאחר הזרקה של 0.05 מ"ל של FITC-dextran, אינדוקציה פקיק phototoxic מוביל הנגע האנדותל היווצרות תקע טסיות הקודקודית (איורים 2 ו 3). במחקר הנוכחי, אינדו...

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים עבור אינדוקצית פקיק המוצלחת התנוך של עכברי ^hr SKH1-HR. לפתרון בעיות, את הצעדים המתאימים של הפרוטוקול מסומנים בסוגריים.

תנאי בחינה הם אידיאליים בחיות צעירות בגיל 4 - 6 שבועות עם cornification הנמוכה של האפידרמיס. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0.5 cm high plane