털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

요약

털이없는 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 귀 모델은 검토 미세 혈관 침대에서 사전 수술 준비없이 미세과 광독성 혈전 유도의 생체 내에 형광 현미경을 할 수 있습니다. 따라서 털이 마우스의 귀는 미세 혈관 혈전 형성, 혈전 진화 및 혈전 용해시 복잡한 상호 작용을 연구하는 생체 모델의 우수합니다.

초록

혈관 질환의 혈전 성 합병증은 선진국의 이환율과 사망률의 한 주요 원인이다. 때문에 혈전 형성시 셀룰러 및 비 셀룰러 혈액 성분 간의 복잡한 상호 작용의 생리 학적 및 병태 생리 혈전증의 신뢰성 시험은 생체 내에서 수행 될 수있다. 따라서이 문서는 털이없는 쥐의 귀 모델을 제시하고, 미세, 혈전 형성 및 혈전 진화의 생체 분석에 초점을 맞추고 있습니다. 생체 내에 형광 현미경 및 형광 염료 각각의 정맥 내 (IV) 애플리케이션을 이용함으로써, 귓바퀴의 미세 순환을 반복 분석을 용이하게 수술 준비 할 필요없이 수행 될 수있다. 또한,이 모델은 상처 치유, 재관류 손상, 또는 혈관 신생 등 다양한 문제의 생체 내 연구에 대해 적용 할 수 있습니다. 요약하면, 털이없는 쥐의 귀는에서 비비안을위한 이상적인 모델입니다생리 학적 또는 병태 생리 학적 조건에서 다른 전신 또는 국소 치료법과의 반응의 평가를 위해 피부의 미세 O 연구.

서문

본 문서의 목적은 직접적인 관찰과 미세 분석, 혈전 형성 및 혈전 진화의 무모 마우스의 귓바퀴에 적용 생체 내에 현미경의 기술을 설명하는 것입니다. 1000 년 1의 발생율로, 정맥 혈전증 여전히 이환율의 일반적인 원인이다. 진단, 예방 전략 및 치료는 최근에 개발되었지만, 정맥 혈전증의 3 분의 1은 폐 색전증 ^1로 나타난다. 동맥 혈전증은 선진국에서 사망의 가장 흔한 원인이되는 심장 혈관 질환에 중요한 역할을한다. 동맥 경화성 플라크의 파열에 따라 동맥 혈전증은 심장 마비, 장간막 경색 및 뇌졸중에 참여하고있다. 모든 수술은, 혈액 성분에 피하 구조를 노출 혈류 역학을 변경하고 환자를 고정시킨다. 낮은 사지, 기관 t의 endoprosthetic 수술에서ransplantation 및 플랩 수술 혈전 합병증의 빈번한 원인입니다. 특히 미세 혈관 혈전증 자주 인해 임상 증상의 부족으로 돌이킬 수없는 손상을 야기한다. 마찬가지로, 미세 혈관 혈전증은 다른 사람의 사이에서 혈전 성 혈소판 감소 성 자반증, 패혈증, 파종 성 혈관 내 응고, 항 인지질 증후군, 만성 정맥 부전, 등 여러 질병에 중요한 규칙을한다.

치료 및 혈전증의 예방을위한 여러 가지 새로운 약물은 최근에 개발되었지만, 항 혈소판 약물과 항 응혈은 여전히 ​​부작용, 부족 길항제가 있고, 장기간 효과가 있습니다. 이 결함은 응급 의료의 문제로 이어집니다. 따라서, 더 많은 연구가 거의 시험 관내에서 모사 될 수 없다 혈전증 동안 발생하는 복잡한 프로세스를 발견 할 필요가있다.

털이없는 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스} 런던 동물원에서 1926 발견되었다.때문에 14 번 염색체에 유전자 결함, 동물이이 선박의 생체 내에 현미경에 액세스 잘 혈관 귓바퀴를 만드는 출생 후 하루 10 후 털을 잃는다. 귀의 평균 두께는 300 μm의입니다. 이것은 연골에 의해 분리되어 진피의 두 층으로 구성. 연골의 볼록 등쪽에서 3 개 혈관 번들 귓불을 입력한다. 혀끝 혈관 호 및 기초 션트는 세 개의 번들을 연결합니다. 세정맥 200 μm의 (기부) 10 ㎛의 (정점) 사이의 직경을 갖는다. 근접 메시 모세 혈관 빈 머리 ² 여포 둘러싸고 있습니다. 털이없는 SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 해부학은 귓바퀴 혈전증 연구를위한 강력하고 비용 효율적인 모델을 만든다.

프로토콜

모든 생체 실험 (7221.3-1-006 / 15) 동물의 보호 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드 (실험 동물 자원 연구소, 국립 연구위원회)에 독일 법률에 따라 실시 하였다.

동물의 1. 일반 상태 유지

1. 4 ~ 6 주 세 남성 SKH1 - 시간의 ^시간의 쥐 실험을 수행합니다. (20)와 25g 사이 무게 동물을 사용합니다.
2. 물과 음식을 자유로이에 지속적으로 액세스하는 무균 시설에서 26 ° C 24의 표준화 된 조건 약 60 %의 상대 습도에서 동물을 유지합니다.
3. 하나 개의 새장에 다섯 개 수컷에 계속. 자신의 웰빙을위한 동물의 하우징 동안 침구와 농축 자료를 제공합니다.

동물 2. 사전 약속

1. (예를 들면, 칸 나비 노이드, 5m 마우스 체중과 각 약물로드인슐린 주사기로 g / kg 체중 (BW)). 혈전 유도하기 전에 약 30 분을 관리.
2. 엄지와 집게 손가락과 새끼 손가락으로 마우스의 꼬리와 마우스의 목을 잡고함으로써, 동물 스트레칭과 복부의 왼쪽 하단 사분면에 약 복강 (IP)을 주입. 15 분 동안 케이지로 다시 동물을 넣습니다.
3. 케타민 (90 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (25 ㎎ / ㎏ 체중)로 마취를 준비한다. 혈전 유발 15 분 전에 마우스를 마취. 케이지에 마우스를 넣어 살짝 꼬리를 당겨, 그리고 인슐린 주사기와 마취제의 IP를 주입.
4. 마취의 발병 때까지 다시 케이지에 마우스를 넣습니다. 충분한 마취를 확인하려면 집게로 꼬리를 꼬집어.
5. 인슐린 주사기로 (5 %, 150 kDa의 FITC 덱스 트란)의 제상 형광 염료 - 표지 된 덱스 트란의 0.05 mL의로드. 주사기를 작성하는 동안, 기포가 남아 있지 않도록 아주 작은 intravenousl 때문에Y는 (IV) -administered 기포 동물 용 치명적일 수있다.
6. 의 인쇄면이 밑으로 가도록 위치에 가열 플레이트에 마취 마우스를 놓습니다. 37 ° C로 가열 플레이트를 조정한다.
7. 마우스의 각막에 눈 연고를 넣습니다. 피부를 소독하고 멸균 악기를 사용합니다.
8. 오른쪽 손잡이의 두개골과 꼬리 가장자리에 폴리 프로필렌 7/0 두 봉합 스티치. 가능 (도 1b)와 같은베이스 가장자리에 근위로 스티치를 놓는다.
9. 지느러미의 위치로 마우스를 이동. 접착제 스트립을 사용하여 acrylglass 플랫폼에 대한 모든 다리를 수정합니다. 앞니 아래에서 봉합사를 걸고 접착제 스트립과 acrylglass에 봉합사를 행해서 배굴에 헤드를 위치.
10. 동작 실체 현미경 아래 플랫폼에 동물을 이동시키다. 16X 배율을 사용합니다.

왼쪽 경정맥과 FITC - 덱스 트란 사출 3. 준비

참고 : 마이크를 들어오른쪽 귀 roscopy은, 왼쪽 경정맥을 준비합니다.

1. 메스를 이용하여, 부교감 꼬리 방향의 목의 왼쪽에있는 피부에 5 mm의 절개를 생성한다. microforceps 및 microscissors와 피하 조직을 해부하다. 폴리 에스테르 8/0 봉합 또는 electrocoagulation와 결찰 교차 선박 중 하나.
2. 혈관을 건드리지 않고 microforceps 및 microscissors를 사용하여 외막에서 정맥 무료.
3. 형광 염료의 주입을 위해 제조 된 인슐린 주사기를 사용한다. 조심스럽게 정맥을 관통하지 않고 microforceps와 혈관 벽을 잡아. 주사기로 팽창 된 혈관 벽을 관통하여 FITC 덱스 트란 IV 주입.
4. 면봉을 사용하여 주사기를 철수 후 출혈을 중지합니다. 혈액을 피하고 귀 오염을 염색.

생체 내에 형광 현미경의 오른쪽 귀 4. 위치

1. acrylglass C까지 가열판에 동물을 이동시켜가열판위한 슬롯과 귀 위치하는 0.5 cm 높이의 평면 onstruction.
2. 접착 스트립을 이용하여 가열 플레이트 상에 동물을 고정면. 귀 선단 부분이 평면에서 평면에 위치 될 수 있도록 귀 (도 1b)에 대해 0.5 cm 높이의면 옆에 귀 기지에서 비교적 강한 볼록 연골 놓는다.
3. 귀를 배치하기 위해 acrylglass 평면에 상온 0.9 %의 NaCl 한 방울을 추가합니다. 오목 복부 측 기정 봉합 0.9 % 염화나트륨 드롭에서 아래쪽으로 향하도록 오른쪽 귀를 놓는다. 면봉을 사용하여, 염화나트륨의 드롭을 흡수하고 모세관 힘이 acrylglass에 귀 평면을 첨부 할 수 있습니다.
4. 귀의 위치를 ​​해결하기 위해 acrylglass에 봉합 테이프로.
5. 귀 볼록 등쪽에 0.9 % NaCl을 실온에서 한 방울을 추가한다. 조심 번째 입력 기저 용기를 압축하지 않고 귀에 한 커버 슬립 (0.5 cm 직경)을 넣어전자 귀. 면봉을 이용하여 커버 슬립하고 귀 혈관 대상 사이의 거리를 최소화하기 위해 커버 슬립 아래에서 최대한의 NaCl을 제거한다.

오른쪽 귀 5. 생체 내에 형광 현미경 및 혈전 유도

1. (-; 510; LP : 520 FT 490 내지 450) FITC 덱스 트란 시각화를위한 생체 내에 형광 현미경을 조정한다. 광원으로 가변 100 W 수은 램프를 사용한다. DVD 레코더에 고해상도 흑백 CCD 카메라를 연결합니다.
2. 생체 내에 형광 현미경의 책상에 고정 납치 귀 가열 플레이트를 포함하는 acrylglass에 동물을 전송합니다.
3. 직경 400의 선행 성 혈류에 60 μm의 - - 600 μm의 / s 20X 배율 (20X / 0.95 개구 수) 20 % 광량을 사용하여 정맥 용기 50를 검색.
4. 63X magnificatio의 수침위한 커버 슬립을 실온에서 물을 적하 추가n 개의 목표 (63X / 0.95 개구 수). 1 mm 직경 정맥 주사기를 사용하여 현미경의 목적의 드롭 놓습니다. 물 방울과 커버 슬립과 목적에 문의 충분한 물을 추가합니다.
5. 즉시 물방울의인가 후, 직경 및 혈액 흐름의 오프라인 측정 20 % 광 강도로 20 초 동안 기록을 시작 용기.
6. FITC 덱스 트란의 주사 후 혈전 유도 5 분 시작. 이러한 목적을 위해, 100 %의 발광 강도를 올릴.
7. 혈전 유도시 혈액 흐름을 체크 30 초의 기간 내에 2 초 동안 현미경의 개구부를 닫는다. 혈액 흐름을 지속하는 경우, 다시 조리개를 연다. 정지 혈류량의 경우, 30 초 동안 혈관을 관찰한다.
   참고 : 흐름이 30 초 이상이나 피가 역행 흐르는 경우 여전히 유효하면 혈관이 폐색으로 분류됩니다. orthograde 혈액의 흐름이 다시 시작되면 완전히 조리개와 CONTIN을 엽니 다 상술 한 바와 같이 UE 혈관 폐색까지 혈전 유도가 발생한다. 조기 혈전 유도시, 상기 개구는 혈류를 확인하는 폐쇄 된 시간은 거의 연속적인 에피 조명을 유지하기 위해 가능한 한 짧은 것을 보장한다. 나중에, 혈전 성장 동안, 용기가 적은 형광 염료 관류이므로 계속 관찰 할 수있다.
8. 선택과 귀 당 5 개 혈관을 폐색. FITC 덱스 트란의 주사 후 약 1 시간에 현미경 혈전 유도 시간을 제한한다.

6. 후속 활동

1. 경피 폴리 프로필렌을 6/0 봉합사를 사용하여 목의 상처 봉합을 수행합니다.
2. 마취에서 회복하는 동안, 케이지에 다시 마우스를 놓고 적외선을 사용하여 동물을 따뜻하게.
3. 혈관과 혈류 속도의 직경의 측정을 가능하게 소프트웨어로 DVD 레코더에서 기록 된 데이터를 전송합니다.

왼쪽 귀의 _title "> 7. 시험

1. 동물 복구하고 48 시간 동안 모든 주입 FITC-덱스 트란을 제거 할 수 있습니다.
2. 상술과 같이, 우측 경정맥 및 좌측 귀를 제조 이번에 재실행.

8. 조직 Asservation

1. 왼쪽 귀의 생체 내에 형광 현미경 후 샘플 0.5 ㎖를 눈 구후 정맥 얼기 혈액의 유리 모세관을 이용. 정맥 혈액이 모세관를 통과 할 때까지 조심스럽게 속이 움직임 내측 눈꺼풀 각 관통. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 혈액 튜브 프로브를 수집.
2. 채혈 후에 꼬리 정맥 내로 500 ㎎ / ㎏ 체중 케타민을 주입하여 동물을 희생.
3. 백혈구, 적혈구, 혈소판, 헤모글로빈 및 적혈구 용적률의 정량적 평가에 대한 혈액 분석기를 사용하여 혈액 세포를 계산합니다.
4. 10m 2,500 XG하고 실온에서 나머지 EDTA 혈액을 원심에. 피펫 및 추가 조사에 대한 혈장을 동결.
5. 가위를 사용하여 귓바퀴을 절감하고 조직 학적 검사에 대한 4 %의 포름 알데히드에 오류를 수정.

결과

혈전의 치료 효과 카나비노이드

FITC 덱스 트란 0.05 mL를 주입하면, 광독성 혈전 유도는 (도 2 및도 3). 내피 병변 및 정수리 혈소판 플러그의 형성을 유도 본 연구에있어서, 칸 나비 노이드의 IP 주입 (5 ㎎ / ㎏ 체중) 또는 비히클 후의 혈전 유도는 모든 세정맥에서 혈전 혈관 폐색 (도 4) 결과. ?...

토론

SKH1 - 시간의 ^{시간 마우스의} 귓불에서 성공적인 혈전 유도에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 문제 해결을 위해 프로토콜의 각 단계는 괄호 안에 표시됩니다.

육주와 표피의 낮은 각화로 - 시험 조건은 4 세의 나이에 젊은 동물에 이상적입니다. 이전 동물에서 혈관의 시각화 품질로 인해 피부 표면과 타겟 용기 (단계 1.1) 사이의 거리보다 더 적은 대등하다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0.5 cm high plane