活体显微镜及血栓诱导在无毛小鼠的耳垂

摘要

无毛SKH1-HR ^hr小白鼠的耳朵模型使而不在检查微血管床之前手术准备微循环和光毒性血栓诱导的活体荧光显微镜。因此，无毛小鼠的耳朵是一个极好的体内模型微血管血栓形成，血栓进化，与溶栓期间学习复杂的相互作用。

摘要

血管疾病的血栓并发症是工业国家的发病率和死亡率的一个主要原因。由于在血栓形成的细胞和非细胞的血液成分之间复杂的相互作用，生理学和血栓形成的病理生理学的研究可靠只能在体内进行。因此，本文提出了在无毛小鼠耳模型，并专注于微循环，血栓形成，血栓和进化的体内分析。通过使用活体荧光显微镜和相应的荧光染料的静脉内（iv）应用程序，能够容易地进行微循环在耳廓的重复分析，而不需要外科手术制备。此外，该模型可以适合于体内的不同问题的研究，包括伤口愈合，再灌注损伤，或血管发生。综上所述，无毛小鼠的耳朵对于在利沃夫的理想模型在生理学或病理生理学条件和它的不同的全身或局部治疗反应的评估皮肤微循环邻研究。

引言

本制品的目的是描述施加到无毛小鼠的耳廓用于直接观察和微循环的分析，血栓形成，和血栓进化活体显微镜的技术。随着1在1000的发病率，静脉血栓形成仍是发病的常见原因。虽然诊断，预防策略和治疗已在近几年得到了发展，静脉血栓形成的三分之一表现为肺动脉栓塞^1。动脉血栓形成在心血管疾病，这是在工业化国家死亡的最常见原因至关重要的作用。基于粥样硬化斑块的破裂动脉血栓形成涉及心脏发作，肠系膜梗死，中风和。每个手术暴露属下的结构中血液成分，改变血流动力学，并固定了病人。在下肢，器官的T人工关节手术ransplantation和皮瓣手术血栓并发症的常见原因。尤其是微血管血栓形成经常导致不可逆的损害，因缺乏临床症状。同样，微血管栓塞起着至关重要的规则在几种疾病，包括血栓性血小板减少性紫癜，败血症，弥漫性血管内凝血，抗磷脂综合征，慢性静脉功能不全，等等。

用于治疗和预防血栓形成的一些新的药物，近年来被开发，但抗血小板药物和抗凝药物仍然有副作用，缺乏拮抗剂，并配备持续时间长的效果。这些缺陷导致紧急医疗问题。因此，需要更多的研究来发现血栓形成，这很难在体外模拟过程中发生的复杂过程。

无毛SKH1-HR ^人力资源小鼠在伦敦动物园里发现了1926年。由于14号染色体上的基因缺陷，动物失去了它的皮毛10日龄后，这使得对血管的活体显微镜访问的良好血管耳廓。耳的平均厚度为300μm。它由真皮的两层，其通过软骨隔开。对软骨的凸背侧，3个维管束进入耳垂。心尖血管弧和基础分流连接三个包。小静脉具有200微米（基础）和10微米（心尖）之间的直径。关闭网状毛细血管周围的空毛囊^2。无毛SKH1-HR ^人力资源鼠标的剖析，使耳廓血栓形成研究的强大和高性价比机型。

研究方案

所有的体内实验（7221.3-1-006 / 15）在符合有关动物保护和NIH指南实验动物的护理和使用（实验动物资源研究所，国家研究理事会）德国法律进行。

1.动物一般饲养

1. 执行与年龄4至6周雄性SKH1-HR ^小时小鼠实验。使用动物用20和25克的重量。
2. 保持动物在无病原体的设施和24至26℃下在标准条件和约60％相对湿度下，以稳定获得水和食物随意 。
3. 跟上只雄性动物在笼子里一个。动物的外壳为他们的幸福过程中提供的床上用品和丰富的材料。

2.动物的预先安排

1. 称重小鼠并装入各自的药物（ 例如，大麻素，5米克/千克体重（BW））转换成胰岛素注射器。施用前血栓感应药物30分钟。
2. 通过保持拇指和食指和用小指的小鼠的尾之间的小鼠的颈部，舒展动物和注射药物腹膜内（IP）到腹部的左下象限。把动物放回笼子15分钟。
3. 用氯胺酮（90毫克/千克体重）和赛拉嗪（25毫克/千克体重）准备麻醉。前血栓诱导15分钟，麻醉小鼠。把鼠标在笼中，稍拉尾部，并与胰岛素注射器注入麻醉剂的ip。
4. 把鼠标放回笼子，直到麻醉起效。为了验证足够的麻醉，掐钳尾。
5. 负载0.05毫升解冻异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖; 5％，150 kDa）的成胰岛素注射器。虽然填充注射器，确保没有气泡残留，因为即使小intravenouslY（IV）-administered气泡可能是致命的动物。
6. 放置麻醉小鼠上的面朝下位置的加热板。调节加热板，以37℃。
7. 把眼膏鼠标的角膜。消毒皮肤，并用消毒器械。
8. 缝合聚丙烯7/0的两根缝线到右耳的头部和尾部边缘。放置尽可能靠近边缘和邻近基尽可能（ 图1B）的线迹。
9. 移鼠标背的位置。修复所有的腿用胶粘带的acrylglass平台。钩门牙下一个缝合线，并通过粘缝合线与粘合带的acrylglass在背屈定位磁头。
10. 转运操作体视显微镜下平台上的动物。使用16X放大倍率。

3.左颈静脉和FITC-葡聚糖的注射液的制备

注:MIC右耳的roscopy，准备左颈静脉。

1. 使用手术刀，创建在脖子上的在头尾方向上的左侧的皮肤上的5毫米切口。解剖用microforceps和microscissors皮下组织。或者结扎血管交叉与聚酯8/0缝合线或与电凝。
2. 使用自由和microforceps从microscissors外膜静脉不接触容器。
3. 使用制备的胰岛素注射器将荧光染料的注入。小心地抓住与microforceps血管壁，无穿孔静脉。穿透扩张血管壁与注射器和注入FITC-葡聚糖IV。
4. 撤销使用棉签，注射器后停止出血。避免血液和染料耳朵的污染。

4.活体荧光显微右耳的定位

1. 在加热板的动物转移到acrylglassÇ。施工与用于加热板的狭槽和用于定位耳0.5厘米高平面。
2. 修复动物面朝下放在使用粘合带的加热板。放置相对较强，而凸软骨在耳根0.5厘米高平面旁边的耳（ 图1B），使得耳朵的顶端部能够在平面上被定位平面。
3. 室温的0.9％NaCl一滴添加到acrylglass平面以便放置耳。将右耳，与面临的凹腹侧预先布置的缝合线向下，在0.9％的NaCl的下降。用棉花棒，吸收氯化钠的下降，让毛细力附着耳朵平面到acrylglass。
4. 大盘缝合到acrylglass修复耳朵的位置。
5. 0.9％室温下的NaCl一滴添加到耳的凸背侧。小心地把一个盖玻片（直径为0.5厘米）在耳朵上而不压缩进入第基底容器Ë耳朵。使用棉签，以便最小化盖玻片和耳靶血管之间的距离从除去盖玻片下尽可能多的NaCl越好。

右耳的活体5荧光显微镜和诱导血栓

1. 调整FITC-葡聚糖可视化活体荧光显微镜（450 - 490纳米; FT:510; LP:520）。使用可变100-W汞灯作为光源。高分辨率，黑色和白色的CCD相机连接到DVD刻录机。
2. 转移在包含与所述固定绑架耳朵到活体荧光显微镜的桌子加热板的acrylglass动物。
3. 在直径和与400的顺行血流60微米 - - 600微米/秒使用20X放大倍率（20X / 0.95的数值孔径）和20％的光强度，搜索静脉容器50。
4. 室温水一滴加入盖玻片为63X magnificatio的水浸泡Ñ物镜（63X / 0.95的数值孔径）。用注射器以1毫米直径的套管，并放置在显微镜的物镜的下降。加入足够的水接触盖玻片，客观与水滴。
5. 水滴的应用后，立即开始与直径和血流的离线测量20％的光强度的记录为20秒的容器中。
6. FITC-葡聚糖的注射后开始血栓诱导5分钟。为此目的，提高的光强度为100％。
7. 在血栓感应，关闭时间为30-S内的显微镜的2秒的孔来检查血液流动。在持续的血流量的情况下，再次打开光圈。在停止血液流动的情况下，观察容器30秒。
   注意:作为闭塞该容器被分类如果流静止30秒或更多，或如果血液逆行流动。如果orthograde血流重新开始，完全开放光圈和CONTIN如上所述UE发生血栓感应直到血管闭塞。在早期血栓感应，确保当光圈被关闭以检查血液流动的时间是为了维持几乎连续的落射照明尽可能短。后来，血栓生长期间，将容器灌注有更少的荧光染料，因此可以连续地被观察到。
8. 选择并堵塞每穗5艘船。限制血栓诱导时在显微镜下大约1小时，FITC-葡聚糖的注射后。

6.后续活动

1. 执行使用经皮聚丙烯6/0缝合颈部的伤口闭合。
2. 在从麻醉中恢复，把鼠标放回笼子，并使用红外光暖动物。
3. 从DVD记录器传送所记录的数据到软件允许血管和血液流速的直径的测量。

_title"> 7。左耳的检查

1. 让动物恢复和消除所有注射FITC葡聚糖48小时。
2. 重新运行此时间制备右颈静脉和左耳上述步骤。

8.组织Asservation

1. 左耳的活体荧光显微镜后，样品0.5毫升的来自眼睛的眼球后静脉丛血液用玻璃毛细管。仔细穿透与旋拧运动的内眼睑角度，直到静脉血液流经毛细管。收集在乙二胺四乙酸（EDTA）血管探头。
2. 血液取样后，通过注射500毫克/公斤体重氯胺酮到尾静脉牺牲动物。
3. 计数使用血液分析仪用于白细胞，红细胞，血小板，血红蛋白和血细胞比容的定量评估的血细胞。
4. 离心剩余的EDTA血液在2500×g下和室温下，10分钟英寸吸管和冷冻血浆作进一步调查。
5. 用剪刀，剪耳和4％的甲醛作病理检查修复。

结果

在血栓形成大麻素治疗的影响

在0.05 ml的FITC-葡聚糖的的注入，光毒性血栓诱导导致内皮损伤和血小板壁层插头的形成（ 图2和3）。在本研究中，血栓感应大麻素的腹膜内注射（5 mg / kg体重）或载体后导致所有小静脉血栓形成的血管闭塞（ 图4）。在载体处理的动物中，时间到血栓形成为430秒?...

讨论

有对成功血栓诱导SKH1-HR ^人力资源小鼠的耳垂几个关键步骤。进行故障排除，协议的各个步骤中括号表示。

考试条件是幼龄动物的理想在4岁 - 6周，与表皮的角化低。在较老的动物中，血管的可视化的质量要差少可比由于皮肤表面和靶血管（步骤1.1）之间的距离更高。

为了防止在考试区域FITC葡聚糖外渗，固定缝线必须尽可能勉强放置越好。在接?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
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