Intravitale Microscopia e Trombo induzione nel lobo di un mouse Hairless

Riepilogo

Il modello orecchio del mouse SKH1-Hr ^hr hairless consente intravitale microscopia a fluorescenza del microcircolo e fototossico induzione trombo senza previa preparazione chirurgica nel letto microvascolare esaminato. Pertanto, l'orecchio del topo glabro è un eccellente modello in vivo per studiare le complesse interazioni durante la formazione di trombi microvascolare, l'evoluzione del trombo, e trombolisi.

Abstract

complicanze trombotiche di malattie vascolari sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei paesi industrializzati. A causa delle complesse interazioni tra cellule ematiche e non cellulari durante la formazione di trombi, studi affidabili della fisiologia e fisiopatologia della trombosi possono essere eseguite solo in vivo. Pertanto, questo articolo presenta un modello orecchio nei topi senza peli e si concentra sull'analisi in vivo del microcircolo, formazione di trombi, e l'evoluzione del trombo. Utilizzando intravitale microscopia a fluorescenza e la via endovenosa (iv) l'applicazione dei rispettivi coloranti fluorescenti, un'analisi ripetitiva di microcircolazione del padiglione auricolare può facilmente realizzabile, senza la necessità di preparazione chirurgica. Inoltre, questo modello può essere adattato per studi in vivo su temi diversi, tra cui la guarigione delle ferite, danno da riperfusione, o di angiogenesi. In sintesi, l'orecchio di topi glabri è un modello ideale per la a vivo studio della microcircolazione cutanea in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche e per la valutazione della sua reazione a differenti trattamenti sistemici o topici.

Introduzione

Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere la tecnica della microscopia intravitale applicata al padiglione auricolare del mouse senza peli per l'osservazione diretta e l'analisi del microcircolo, formazione di trombi, ed evoluzione trombo. Con un'incidenza di 1 a 1.000, trombosi venosa è ancora una causa comune di morbidità. Anche se la diagnostica, le strategie di prevenzione e le terapie sono stati sviluppati negli ultimi anni, un terzo di trombosi venosa si manifesta come un'embolia polmonare ^1. trombosi arteriosa gioca un ruolo fondamentale nelle malattie cardiovascolari, che sono la causa più comune di morte nei paesi industrializzati. trombosi arteriosa in base alla rottura di placche aterosclerotiche è coinvolto in attacchi cardiaci, infarti mesenterici, e un colpo apoplettico. Ogni intervento chirurgico espone strutture subendoteliali ai componenti del sangue, cambia la dinamica del flusso di sangue, e immobilizza il paziente. Nella chirurgia endoprotesico del arto inferiore, t organoransplantation e trombosi chirurgia lembo sono spesso causa di complicazioni. Microvascolare trombosi in particolare provoca spesso danni irreversibili, a causa della mancanza di sintomi clinici. Analogamente, trombosi microvascolare gioca un ruolo cruciale in diverse patologie, incluse porpora trombotica trombocitopenica, sepsi, coagulazione intravascolare disseminata, sindrome antifosfolipidi, e insufficienza venosa cronica, tra gli altri.

Diversi nuovi farmaci per la terapia e la prevenzione della trombosi sono stati sviluppati negli ultimi anni, ma i farmaci antiaggreganti e anticoagulanti hanno ancora effetti collaterali, antagonisti mancanza, e presentano gli effetti di lunga durata. Queste carenze portano a problemi di assistenza medica di emergenza. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per scoprire i complessi processi che si verificano durante la trombosi, che difficilmente può essere simulato in vitro.

Il topo glabro ^hr SKH1-Hr è stato scoperto 1926 in uno zoo di Londra.A causa di un difetto genetico sul cromosoma 14, l'animale perde il pelo dopo postnatale giorno 10. Questo rende il padiglione auricolare ben vascolarizzato accessibile a microscopia intravitale dei vasi. Lo spessore medio dell'orecchio è di 300 micron. È costituita da due strati di derma, che sono separati da cartilagine. Sul lato dorsale convessa della cartilagine, 3 fasci vascolari entrano lobo. archi vascolari apicali e basali shunt collegano i tre fasci. Venule hanno diametri tra 200 um (basale) e 10 um (apicale). Capillari a maglie strette circondano i capelli vuoto follicoli ^2. L'anatomia del mouse ^hr SKH1-Hr glabro rende il padiglione auricolare un modello potente e conveniente per la ricerca trombosi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti in vivo (7221.3-1-006 / 15) sono state condotte in conformità con la legislazione tedesca in materia di protezione degli animali e la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto di laboratorio risorse animali, Consiglio Nazionale delle Ricerche).

1. Mantenere generale degli animali

1. Eseguire gli esperimenti con i topi ^hr SKH1-Hr maschi di età compresa tra 4 a 6 settimane. Utilizzare gli animali con un peso compreso tra 20 e 25 g.
2. Tenere gli animali in un impianto privo di patogeni e in condizioni standardizzate di 24 a 26 ° C e circa il 60% di umidità relativa, con accesso costante ad acqua e cibo ad libitum.
3. Mantenere fino a cinque animali di sesso maschile in una gabbia. Fornire materiale per lettiere e arricchimento durante la custodia degli animali per il loro benessere.

2. Predisposizione degli Animali

1. Pesare un mouse e caricare il rispettivo farmaco (ad esempio, il cannabinoide, 5 mg / kg di peso corporeo (pc)) in una siringa da insulina. Somministrare il farmaco 30 minuti prima dell'induzione trombo.
2. Mantenendo il collo del mouse tra il pollice e il dito indice e la coda del topo con il mignolo, allungare l'animale e iniettare il farmaco per via intraperitoneale (ip) nel quadrante inferiore sinistro dell'addome. Mettere l'animale nella gabbia per 15 min.
3. Preparare anestesia con ketamina (90 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (25 mg / kg di peso corporeo). 15 min prima dell'induzione trombo, anestetizzare il mouse. Mettere il mouse nella gabbia, tirare un po 'la coda, e iniettare l'ip anestetici con una siringa da insulina.
4. Mettere il mouse avanti nella gabbia fino a quando l'induzione dell'anestesia. Per verificare anestesia sufficiente, pizzicare la coda con una pinza.
5. Carico 0,05 ml di fluoresceina destrano scongelato isotiocianato-marcato (FITC-destrano, 5%, 150 kDa) in una siringa da insulina. Durante il riempimento della siringa, assicurarsi che non rimangano bolle d'aria, in quanto anche piccole intravenously (iv) bolle d'aria -administered può essere letale per l'animale.
6. Posizionare il mouse anestetizzato su una piastra di riscaldamento nella posizione a faccia in giù. Regolare la piastra riscaldante a 37 ° C.
7. Mettere pomata oculare sulla cornea del mouse. Disinfettare la pelle e utilizzare strumenti sterili.
8. Stitch due punti di sutura di polipropilene 7/0 nel bordo craniale e caudale l'orecchio destro. Posizionare i punti più vicino al bordo e come prossimale alla base possibile (Figura 1B).
9. Spostare il mouse per posizione dorsale. Fissare tutte le gambe alla piattaforma acrylglass utilizzando strisce adesive. Agganciare una sutura sotto i denti anteriori e posizionare la testa in dorsiflessione attaccando la sutura al acrylglass con strisce adesive.
10. Traslocare l'animale sulla piattaforma con lo stereomicroscopio operazione. Utilizzare 16X di ingrandimento.

3. Preparazione della sinistra Vena giugulare e Iniezione di FITC-destrano

Nota: Per microscopy dell'orecchio destro, preparare la vena giugulare sinistra.

1. Usando un bisturi, creare un'incisione 5 mm nella pelle sul lato sinistro del collo in una direzione cranio-caudale. Sezionare il tessuto sottocutaneo con microforceps e microscissors. Entrambi navi attraversamento legare con poliestere 8/0 suture o con elettrocoagulazione.
2. Liberare la vena dalla sua avventizia utilizzando microforceps e microscissors senza toccare il vaso.
3. Utilizzare la siringa di insulina preparata per l'iniezione del colorante fluorescente. afferrare con cautela la parete del vaso con le microforceps, senza perforare la vena. Penetrare la parete del vaso disteso con la siringa e iniettare iv FITC-destrano.
4. Fermare l'emorragia dopo il ritiro della siringa usando tamponi di cotone. Evitare la contaminazione del sangue e tingere dell'orecchio.

4. Posizionamento dell'orecchio destro per intravitale microscopia a fluorescenza

1. Trasferire l'animale sulla piastra di riscaldamento a un acrylglass construction con uno slot per la piastra di riscaldamento e lle 0.5 cm di altezza aereo per posizionare l'orecchio.
2. Fissare l'animale faccia sulla piastra di riscaldamento mediante strisce adesive. Posizionare la cartilagine relativamente forte e convessa alla base dell'orecchio accanto 0,5 cm di altezza aereo per l'orecchio (Figura 1B) in modo che la parte apicale dell'orecchio può essere posizionato piatto sul piano.
3. Aggiungere una goccia di temperatura ambiente 0,9% di NaCl al piano acrylglass al fine di posizionare l'orecchio. Mettere l'orecchio destro, con i punti di sutura predisposti sul suo lato ventrale concava rivolta verso il basso, sul calo del 0,9% NaCl. Utilizzando tamponi di cotone, di assorbire il calo di NaCl e lasciare che le forze capillari attaccano il piano orecchio al acrylglass.
4. Nastro i punti di sutura al acrylglass per fissare la posizione dell'orecchio.
5. Aggiungere una goccia di 0,9% di NaCl temperatura ambiente al lato dorsale convesso dell'orecchio. Attentamente mettere un coprioggetto (0,5 cm di diametro) sull'orecchio senza comprimere i vasi basali entrano the orecchio. Utilizzando tamponi di cotone, rimuovere il più NaCl possibile da sotto il vetrino al fine di minimizzare la distanza fra il vetrino ei vasi bersaglio orecchio.

5. intravitale microscopia a fluorescenza e trombo induzione dell'orecchio destro

1. Regolare il microscopio a fluorescenza intravitale per la visualizzazione FITC-destrano (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Utilizzare una lampada a mercurio da 100 W variabile come fonte di luce. Collegare ad alta risoluzione, fotocamera CCD in bianco e nero per un registratore DVD.
2. Trasferire l'animale sulla acrylglass contenente la piastra di riscaldamento con l'orecchio rapito fissato alla scrivania del microscopio a fluorescenza intravitale.
3. Utilizzando 20X (20X / 0,95 apertura numerica) e l'intensità luminosa 20%, cercare un vaso venoso 50 - 60 micron di diametro e con un flusso sanguigno anterogrado 400 - 600 _M / s.
4. Aggiungere una goccia di acqua a temperatura ambiente al vetrino per immersione in acqua del 63x magnificatioobiettivo n (63X / 0,95 apertura numerica). Utilizzare una siringa con una cannula del diametro di 1 mm e posizionare la goccia sull'obiettivo del microscopio. Aggiungere acqua quanto basta per contattare il vetrino e l'obiettivo con la goccia d'acqua.
5. Immediatamente dopo l'applicazione della goccia d'acqua, iniziare la registrazione del recipiente per 20 s con intensità luminosa 20% per la misura in linea del flusso diametro e sangue.
6. Inizia trombo induzione 5 minuti dopo l'iniezione di FITC-destrano. A tale scopo, aumentare l'intensità luminosa al 100%.
7. Durante l'induzione trombo, chiudere l'apertura del microscopio per 2 s entro un periodo di 30 s per controllare il flusso di sangue. In caso di ulteriore flusso di sangue, aprire nuovamente il diaframma. In caso di flusso sanguigno fermato, osservare la nave per 30 s.
   NOTA: Il vaso è classificato come occlusa se il flusso si è fermato per 30 s o più, o se il sangue scorre retrograda. Se il flusso di sangue orthograde ricomincia, aprire completamente l'apertura e Contin ue l'induzione trombo fino occlusione di vasi avviene come descritto sopra. Durante la prima induzione trombo, assicurano che i tempi in cui il diaframma è stato chiuso per controllare il flusso di sangue sono più breve possibile al fine di mantenere pressoché continuo epi-illuminazione. Successivamente, durante la crescita di trombi, la nave è perfuso con colorante fluorescente meno, in modo che possa essere osservato continuamente.
8. Selezionare e occlude 5 navi per orecchio. Limitare il tempo di induzione trombo al microscopio per circa 1 h dopo l'iniezione di FITC-destrano.

6. Seguito dato Attività

1. Eseguire un chiusura della ferita del collo usando polipropilene transcutanea 6/0 punti di sutura.
2. Durante il recupero dall'anestesia, mettere il mouse nella gabbia e riscaldare l'animale usando la luce infrarossa.
3. Trasferire i dati registrati dal registratore DVD al software che permette la misurazione del diametro dei vasi e la velocità del flusso sanguigno.

_title "> 7. Esame dell'orecchio sinistro

1. Lasciate che l'animale recuperare ed eliminare tutti iniettato FITC-destrano per 48 ore.
2. Eseguire nuovamente i passi sopra descritti, questa volta prepara il diritto vena giugulare e l'orecchio sinistro.

8. Tessuto Asservation

1. Dopo intravitale microscopia a fluorescenza dell'orecchio sinistro, campione da 0,5 ml di sangue dalla vena retrobulbare plesso dell'occhio utilizzando un capillare di vetro. penetrare accuratamente l'angolo palpebrale interno con movimenti avvitamento, finché il sangue venoso fluisce attraverso il capillare. Raccogliere la sonda in un acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) tubo di sangue.
2. Dopo il prelievo del sangue, sacrificare l'animale iniettando 500 mg / kg di peso corporeo ketamina nella vena caudale.
3. Contare le cellule del sangue utilizzando un analizzatore ematologico per una valutazione quantitativa dei leucociti, eritrociti, trombociti, emoglobina, ematocrito e.
4. Centrifugare il sangue EDTA rimanendo a 2.500 xg e temperatura ambiente per 10 ma. Pipetta e congelare il plasma sanguigno per ulteriori indagini.
5. Utilizzando forbici, tagliare gli atri e fissarli in formaldeide al 4% per l'esame istologico.

Risultati

Effetti del trattamento cannabinoidi su trombogenesi

Sull'iniezione di 0,05 mL di FITC-destrano, fototossica induzione trombo porta ad una lesione endoteliale e la formazione di un tappo di piastrine parietale (figure 2 e 3). Nel presente studio, induzione trombo dopo l'iniezione ip di cannabinoidi (5 mg / kg di peso corporeo) o un veicolo determinato un'occlusione trombotica recipien...

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici per l'induzione trombo successo nel lobo di topi ^hr SKH1-HR. Per problemi, le rispettive fasi del protocollo sono indicati tra parentesi.

condizioni di esame sono ideali in animali giovani all'età di 4 - 6 settimane ed a basso cheratinizzazione dell'epidermide. Negli animali più vecchi, la qualità di visualizzazione dei vasi è peggiore e meno paragonabili a causa della distanza maggiore tra la superficie della pelle e dei vasi bersa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0.5 cm high plane