JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد قمنا بتطوير نظام الفحص الإنتاجية العالية وحدات لاكتشاف مركبات جديدة ضد السل المتفطرة، تستهدف داخل وفي مرق تزايد البكتيريا وكذلك السمية الخلوية ضد الخلية المضيفة الثدييات.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

المتفطرة السلية، العامل المسبب لمرض السل (TB)، هو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. TB الحساس للأدوية هو مرض قابل للعلاج يتطلب مضادات حيوية متعددة لمدة 6 أشهر. على الرغم من كونه مرض قابل للعلاج، وقدرت نسبة الوفيات بمرض السل أن يكون 1.5 مليون في عام 2015 1. في السنوات ال 10 الماضية، كانت هناك زيادة المخاوف من انتشار M. السل المقاوم للأدوية. يتم تعريف للأدوية المتعددة مقاومة السل (MDR-TB) كما TB التي هي مقاومة على الأقل أيزونيازيد (INH) وريفامبيسين (RMP)، ومعظم سلالات السل المقاوم للأدوية المتعددة هي أيضا مقاومة لتحديد الأدوية TB الخط الثاني، مما يحد من خيارات العلاج . آثار مقاومة المخدرات تخلق تحديا أكبر لعلاج المرضى الذين يعانون شارك في المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV). 400000 المرضى في جميع أنحاء العالم توفي من مرض السل المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية في عام 2015 1. مخيبة للآمال، والولايات المتحدة الأمريكية للغذاء والدواء Administوقد وافقت التموينية واحد فقط المخدرات TB جديدة ضد MDR-TB، bedaquiline، في السنوات ال 40 الماضية 2. هناك حاجة ماسة إلى التقدم في إيجاد علاجات أفضل وأقصر TB من أجل البقاء قدما في مكافحة السل وMDR-TB.

تقليديا، يتم تنفيذ الشاشات المخدرات TB تحت في المختبر ظروف النمو في متوسط النمو، حيث تتم إضافة مركبات للثقافة متنامية ويتم تحديد فعاليتها في القضاء على الكائنات الحية الدقيقة عن طريق عد مستعمرة (كفو) في وسط صلب. كما تعول CFU هي كثيفة العمالة، تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة، وقد وضعت وسائل غير مباشرة مختلفة للتخفيف من حدة هذه المشكلة. وتشمل هذه الأساليب في الامار الأزرق جدوى فحص 3، وتحديد مضان 4 من البروتين الأخضر الفلورسنت (GFP) أو التلألؤ 5 من البكتيريا، معربا عن وسيفيراز، وتقدير مجموع أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) 6 و 7.

يتميز TB نموذجي من عدوى السل M. في الرئة، حيث تتواجد البكتيريا وتتكاثر داخل جسم بلعمي الضامة السنخية 8. الشاشة المظهرية بسيطة في مرق قد تتناسب مع مسببات الأمراض خارج الخلية. ومع ذلك، في المنظور التاريخي، وأصيب المركبات ضد M. السل التي تم تحديدها باستخدام هذه الطريقة غالبا ما تفشل في الارتقاء إلى مستوى التوقعات خلال خطوات التحقق من صحة المصب في نماذج العدوى. نقترح أن المخدرات TB يتم تنفيذ الأفضل في نموذج عدوى الخلية المضيفة داخل الخلايا. ومع ذلك، ونماذج الخلايا تمتلك العديد من الحواجز التكنولوجية والبيولوجية لفحص (HTS) تطوير الإنتاجية العالية. وهناك عقبة كبيرة هي تعقيد عملية العدوى، والتي تجسدت خطوات عديدة وإزالة متطورة من البكتيريا خارج الخلية التي كتبها في الفترات الفاصلة بين الغسيل. وهناك عقبة رئيسية الثانية هي المرة إعادة طويلةيتطلبه، كما كشف عن النمو، ويتم عادة CFU تعول على لوحات ثقافة، هي العملية التي تستغرق أكثر من 3 أسابيع لإكمال. تم توفير حل واحد ليحل محل التهم CFU بواسطة المجهر الفلورسنت الآلي في تركيبة مع البكتيريا الفلورسنت. ومع ذلك، هذا الحل يتطلب الاستثمار في المعدات الأولي الذي هو خارج عن متناول العديد من مختبرات البحوث. ومن شأن ومنخفضة التكلفة بسيطة، والأمراض ذات الصلة طريقة HTS يعزز إلى حد كبير عملية اكتشاف المخدرات.

في هذه الدراسة، ونحن التقرير نظام HTS جديد، وحدات التي تهدف إلى توفير السريع، وتدرجية عالية، بعد اقتصادي، فحص مناسبة لتحديد النشاط من المركبات ضد الخلايا السل M.. ويتكون هذا النظام من ثلاث وحدات: (ط) داخل الخلايا، (ب) السمية الخلوية، و (iii) فحوصات في المرق. توفر النتيجة النهائية مجتمعة وصفا شاملا للخصائص مركب، مع معلومات إضافية عن الوضع المحتمل للعمل. هذا الشورينظام reening استخدمت في العديد من المشاريع مع المكتبات مجمع المختلفة التي تستهدف طريقة العمل، بما في ذلك تحليل التآزر المخدرات 9، وتحفيز الالتهام الذاتي 10، وتثبيط M. السل -secreted عامل الضراوة (غير منشورة). كما تم دراسة المركبات من وضع غير معروف من عمل 11. اعتمد نسخة معدلة من هذا الأسلوب أيضا شريك صناعي لدينا كأسلوب غربلة أولية لتحديد مركبات جديدة ضد الخلايا السل M. 11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. سلالة بكتيرية والنمو المتوسطة

  1. جعل سكر العنب الزلال وحل الأسهم الملح (ADS) من خلال الانحلال 25 غرام من الزلال المصل البقري، 10.0 غرام من سكر العنب، و4.05 غرام من كلوريد الصوديوم في 460 مل من الماء منزوع الأيونات. تصفية تعقيم ADS وتخزينها في 4 ° C.
  2. جعل 7H9 مرق من خلال إضافة 4.7 غرام من مسحوق 7H9 و 2 مل من الجلسرين 900 مل من الماء النقي. الأوتوكلاف مرق 7H9 على 121 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والسماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة. جعل 7H9ADST بإضافة 100 مل من ADS و 0.5 مل من Tween80 إلى 900 مل من مرق 7H9. تخزينها في 4 ° C.
  3. تزن 50 ملغ من كبريتات كانامايسين وتذوب في 1 مل من الماء منزوع الأيونات. التركيز النهائي هو 50 ملغ / مل. تصفية تعقيم وتخزين في -20 ° C. إضافة 0.5 مل من الكانامايسين حل سهم لكل 1 لتر من 7H9ADST.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا متوسطة جديدة، لذلك حجم وحدات التخزين بشكل مناسب وفقا لحجم الثقافة.
  4. تنمو السل M. في 7Hتستكمل 9ADST مع كانامايسين في الثقافة واقفا. يهز الثقافة يوميا وتمييع قبل أن يصل OD600 1.0 لتجنب تراكمها.
    ملاحظة: سلالة السل M. المستخدمة في تطوير هذه الطريقة كان H37Rv تحولت مع pJAK2.A البلازميد 12. pJAK2.A هو البلازميد التكاملي على أساس ناقلات pMV361، والذي يسمح التعبير رفيع المستوى من الجين يراعة luciferase من المروج hsp60 ويمكن اختيار باستخدام كانامايسين.

2. THP-1 المتوسطة والصيانة

  1. إضافة 50 مل من الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) و 5 مل من 200 ملي L-الجلوتامين إلى 500 مل من RPMI 1640 لجعل RPMI المتوسطة ناقصة (حوالي 10٪ FBS و 2 الجلوتامين ملم).
  2. الحفاظ على ثقافة الخلية THP-1 وفقا لبروتوكول قياسي 13. لفترة وجيزة، وتنمو THP-1 الخلايا في RPMI المتوسطة ناقصة مع الحفاظ على كثافة خلية من ،2-1٬000٬000 في مل من المتوسط ​​بين نظام تقييم الأداءحكماء.

3. فحص عالية الإنتاجية داخل الخلايا عن طريق معربا عن luciferase المراسل M. السل H37Rv

  1. قياس الكثافة البصرية لتعليق البكتيرية بنشاط متزايد في معمل عند طول موجي 600 نانومتر. حساب كثافة البكتيرية باستخدام عامل التحويل من 0.1 OD 600 = 3 × 10 7 بكتيريا لكل مليلتر.
  2. ماصة البكتيريا كافية لعدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10: 1 في أنبوب الطرد المركزي الجديدة. بيليه في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السائل. إضافة 50 ميكرولتر من المصل البشري إلى 450 ميكرولتر من RPMI1640. مقياس حجم تخصيص قيم لهذه التجربة.
  3. ليستطهي البكتيريا، إعادة تعليق بيليه في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 8 بكتيريا في كل 500 ميليلتر من RPMI1640 المحتوية على مصل الإنسان 10٪. السماح للخليط لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تحديد THP-1 خلية كثافة الثقافة عن طريق العد مع عدادة الكريات وmicrosco مقلوببي.
  4. بيليه الخلايا في أنابيب الطرد المركزي معقمة في 100 x ج و 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نضح في وطاف resuspend الخلايا في RPMI غير مكتملة في مناطق ذات كثافة من 1 مليون خلية لكل مليلتر. إضافة phorbol 12 ميريستيت-13-خلات (PMA) إلى 40 نانوغرام / مل تركيز النهائي.
    ملاحظة: سيتم يشار إلى ذلك المزيج التمايز.
  5. الجمع بين opsonized السل M. مع مزيج التمايز THP-1 في وزارة الداخلية من 10: 1 وقسامة المزيج النهائي في 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة بيضاء 96-جيدا مسطحة القاع. يحرك الخليط بانتظام لضمان الاتساق. السماح للتمايز وعدوى والمضي قدما ليلا 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
  6. يغسل الآبار مرتين مع 100 ميكرولتر من RPMI لكل منهما. إضافة مركبات مخففة للتركيز المطلوب في RPMI غير مكتملة واحتضان لمدة 3 أيام.
  7. نضح في المتوسط ​​من الآبار. إضافة 50 ميكرولتر من كاشف فحص وسيفيراز إلى كل بئر. ختم لوحات مع تيransparent السدادات لوحة لاصقة. سماح 5 دقائق من الحضانة عند 22 درجة مئوية ومن ثم الحصول على قراءات في luminometer في 1 ثانية لكل بئر.

4. تحليل السمسة باستخدام 3- (4،5-Dimethylthiazol-2-YL) -2،5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT) فحص 14

  1. التفريق THP-1 الخلايا في RPMI تستكمل كاملة مع 40 نانوغرام / مل من سلطة النقد الفلسطينية في واضحة لوحات 96-جيدا. الحفاظ على كثافة الخلية 1 مليون لكل مليلتر وقسامة 100 ميكرولتر لكل بئر. السماح التمايز والمضي قدما ليلا 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
  2. نضح المتوسط ​​من الآبار وغسلها مرتين مع RPMI 1640. اضافة مركبات مخففة في RPMI غير مكتملة إلى الآبار. احتضان لمدة 3 أيام.
  3. حل 0.5 غرام من MTT في 100 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لجعل حل الأسهم من 5 ملغ / مل. تصفية العقيمة وتخزينها في -20 ° C، بعيدا عن الضوء. فمن الأفضل لجعل هذا الحل الطازجة.
  4. 2.5 ساعة قبل احتسابه نهاية فترة الحضانة لمدة 3 أيام، إضافة 25 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر واستكمال فترة الحضانة.
  5. تجهيز 50٪ N، N -dimethyl الفورماميد (DMF) عن طريق خلط 250 مل من DMF مع 250 مل من الماء منزوع الأيونات.
  6. إعداد استخراج العازلة MTT على النحو التالي: وزن 100 غرام من SDS في زجاجة 500 مل وإضافة 300 مل من 50٪ DMF. تطبيق الحرارة المنخفضة للسماح للSDS إلى حل. إضافة 10 مل من حمض الخليك النقي و 12.5 مل من 1 M حمض الهيدروكلوريك. ملء ما يصل الى علامة 500 مل مع 50٪ DMF. التشكيل النهائي لاستخراج العازلة هو 50٪ DMF، و 20٪ SDS، 2.5٪ حامض الخليك، و 2.5٪ 1 M حمض الهيدروكلوريك.
  7. في نهاية فترة العلاج، إضافة 100 ميكرولتر من استخراج العازلة (درجة حرارة 45 ° C حل أي بلورات) إلى كل بئر. السماح للخليط لاحتضان ليلا 37 ° C في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. قراءة الامتصاصية في 570 نانومتر.
    ملاحظة: من الأفضل أداء في مقايسة السمسة بالتوازي مع intracellشاشة ular باستخدام نفس الدفعي وعمر THP-1 الخلايا.

5. في ومرق تحليل آخر باستخدام ريسازورين الفحص 3

  1. تنمو السل M. في 7H9ADST إلى مرحلة منتصف السجل (~ 0،5-0،8 OD 600). تمييع الثقافة مع 7H9ADST إلى 0.01 OD 600. تمييع المركبات في 7H9ADST إلى 2x تركيزات الاختبار وقسامة 100 ميكرولتر من كل مجمع المخفف في كل بئر.
  2. نقل 100 ميكرولتر من تعليق البكتيرية مخففة في كل بئر. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب لمدة 5 أيام. حل 10 ملغ من ريسازورين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات وتصفية العقيمة.
  3. إضافة 30 ميكرولتر من محلول ريسازورين ورصد تغير اللون بعد 48 ساعة. يشار نمو البكتيريا عن طريق تحويل اللون من الأزرق إلى اللون الوردي.
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء تحليل الكمي عن طريق قياس إما مضان في 590 نانومتر مع الإثارة في 530-560نانومتر أو الامتصاصية في 570 نانومتر و 600 نانومتر (15).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الإنتاجية العالية فحص الخلايا باستخدام M. السل التعبير عن الجينات وسيفيراز

الشكل 2A والجدول 1 يحتوي على البيانات الخام التي تم جمعها من قبل luminometer، أعرب في وحدات الانارة ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وكان الهدف من هذه الدراسة هو إيجاد طريقة HTS بسيطة وفعالة من حيث التكلفة باستخدام نموذج العدوى داخل الخلايا البشرية لM. السل. والسل هو مرض يصيب الإنسان تتميز إصابة الضامة السنخية التي كتبها M. السل. بسبب قضايا السلامة الأحيائية، وقد استخدم البحوث التي تنطوي عل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare no competing financial interests for this work.

Acknowledgements

This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640Sigma-AldrichR5886
L-glutamineSigma-AldrichG7513
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific12483020
Middlebrook 7H9Becton, Dickinson and Company271210
Tween80Fisher ScientificT164
Albumin, Bovine pH7Affymetrix10857
DextroseFisher ScientificBP350
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358
kanamycin sulfateFisher ScientificBP906
PMASigma-AldrichP8139
MTTSigma-AldrichM2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)Fisher ScientificD131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)Fisher Scientific351279212
Acetic acidFisher Scientific351269
SDSFisher ScientificBP166
ResazurinAlfa AesarB21187
DMSOSigma-AldrichD5879
GlycerolFisher ScientificBP229
THP-1American Type Culture CollectionTIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plateCorning3917
95-well flat bottom clear plateCorning3595
Transparent plate sealerThermo Fisher ScientificAB-0580
SpectrophotometerThermo Fisher ScientificBiomate 3
Microplate spectrophotometerBiotekEpoch
luminometerApplied BiosystemsTropix TR717

References

  1. WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
  2. USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
  3. Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
  4. Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
  5. Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
  6. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  7. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57(2010).
  8. Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
  9. Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
  10. Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691(2012).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
  12. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
  13. ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
  14. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
  15. Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
  16. Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
  17. Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
  18. Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
  19. Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
  20. Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
  21. Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
  22. Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
  23. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
  24. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960(2014).
  25. Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
  26. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777(2010).
  27. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114(2014).
  28. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645(2009).
  29. Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122 THP1 MTT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved