Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Özet

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Özet

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Giriş

Mycobacterium tuberculosis, Tüberküloz (TB) neden olan madde, dünyada morbidite ve mortalitenin başlıca nedenidir. İlaç duyarlı TBC 6 aylık bir süre için birden fazla antibiyotik gerektiren tedavi edilebilir bir hastalıktır. Tedavi edilebilen bir hastalık olmasına rağmen, TBC ölüm 2015 ¹ 1.5 milyon olarak tahmin edilmiştir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, ilaca dirençli M. tuberculosis yaygınlığı kaygıları var artmaktadır. Ilaca dirençli TB (MDR-TB), en azından isoniazid (INH) ve Rifampisin (RMP), ve en çok MDR-TB kökler böylece tedavi seçenekleri sınırlayıcı ikinci satırı TBC ilaçların seçilmesi de dirençlidir dirençli TB olarak tanımlanmaktadır . ilaç direnci etkilerini İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV) ile ko-enfekte hastaların tedavisi için daha büyük bir sorun oluşturabilir; 400.000 kadar hasta 2015 ^{1 'de} HIV ile ilişkili TB öldü. Hayal kırıklığıyla, ABD Gıda ve İlaç Dairesi'ninrasyon Son 40 yılda ^2, MDR-TB, Bedaquiline karşı tek yeni TB ilacı onayladı. Daha iyi ve daha kısa TB terapileri bulmakta gelişmeler acilen TB ve MDR-TB ile mücadelede önde kalabilmek için ihtiyaç vardır.

Geleneksel olarak, TB ilaç ekranlar bileşiklerin artan bir kültüre ilave edilmiştir ve mikroorganizmalar yok etmek etkinlikleri katı ortam üzerinde koloni oluşturan birim (CFU) sayımı ile tespit edilir ve böylece büyüme ortamında in vitro büyüme koşulları altında gerçekleştirilir. CFU sayımları emek yoğun, zaman tüketen ve masraflı olduğu için, çeşitli dolaylı yöntemler bu sorunu hafifletmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemler, Alamar Mavisi canlılığı deneyi ^3, yeşil floresan protein (GFP) veya lusiferaz sentezleyen bakterilerden lüminesans ^5'ten floresan ⁴ belirlenmesini ve toplam adenozin trifosfat tahmin (A içerirTP) ^{6, 7.}

Tipik TB bakterileri bulunan ve alveoler makrofajlar ⁸ fagozomların içinde replike akciğer, bir M. tuberculosis enfeksiyonuna ile karakterize edilir. basit-et suyu fenotipik ekran hücre dışı patojenlerin uygun olabilir; Ancak tarihsel perspektifte, bu yöntem kullanılarak tespit M. tuberculosis bileşikler genellikle enfeksiyon modellerinde mansap doğrulama adımları sırasında beklentileri yaşamak için başarısız çarptı. Biz TB ilaç iyi bir intraselüler konakçı hücresi enfeksiyon modelinde yapılır öneriyoruz. Bununla birlikte, hücre içi modeller yüksek verimli tarama (HTS) gelişimine birçok teknolojik ve biyolojik engelleri sahiptirler. Büyük bir engel sayıda adımları ve yıkama-arasında hücre dışı bakteri ayrıntılı çıkarılması ile örneklenen, enfeksiyon süreci karmaşıklığıdır. İkinci büyük engel uzun zaman yeniden olduğunugerekliliklerine göre çıkarılabilirdir normal CFU kültür levhaları üzerinde sayılarak yapılır büyüme tespiti olarak tamamlamak için üzerinde 3 hafta süren bir işlemdir. CFU sayımları yerine bir çözüm floresan bakteri ile birlikte otomatik floresan mikroskobu tarafından sağlanmıştır. Ancak bu çözüm birçok araştırma laboratuvarları için ulaşamayacağı bir başlangıç ​​ekipman yatırım gerektirir. Basit, düşük maliyetli ve hastalığa ilgili HTS yöntemi büyük ölçüde ilaç keşif sürecini artıracak.

Bu çalışmada, hücre içi M. tuberculosis bileşiklerin aktivitesini belirlemek için uygun bir hızlı ve yüksek ölçekli, ancak ekonomik, tahlil sağlamayı hedefleyen yeni modüler HTS sistemi bildirmektedir. (I), hücre içi, (ii) sitotoksisite, ve (iii) 'de-et suyu çorbası deneyleri: Bu sistem üç modülden oluşmaktadır. Birleştirilen Nihai sonuç işlevinin potansiyel modu için ek bilgi ile, bileşik özelliklerinin geniş kapsamlı bir açıklama sağlar. Bu scsistem reening ilaç sinerji ⁹ analizi de dahil olmak üzere etki modu hedef çeşitli bileşik kütüphaneleri, çeşitli projelerde kullanılmıştır, otofajinin ¹⁰ stimülasyonu ve M. tuberculosis inhibisyonu, hastalık oluşturma faktörü (yayınlanmamış) tarafından salgılanan. Eylem bilinmeyen modu bileşikleri ayrıca ¹¹ incelenmiştir. Bu yöntemin bir tadil edilmiş bir versiyonu da, hücre içi, M. tuberculosis ¹¹ karşı yeni bileşiklerin belirlenmesi için birinci tarama yöntemi olarak endüstriyel ortak tarafından kabul edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Bakteriyel soyun ve Gelişim Ortamı

1. büyükbaş hayvan serum albümini, 25 g dekstroz, 10.0 g, deiyonize su, 460 mL sodyum klorür, 4.05 g çözündürülmesi ile albümin dekstroz ve tuz stok çözeltisi (ADS) konur. 4 ° C'de ADS ve mağaza Filtre sterilize.
2. 7H9 toz, 4.7 g ve arıtılmış suyun 900 mL gliserol 2 ml ilave edilerek 7H9 suyu olun. 10 dakika boyunca 121 ° C 'de 7H9 suyu Otoklav ve devam etmeden önce, oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. ADS 100 mL ve 7H9 suyu 900 mL Tween® 80, 0.5 mL ilave edilerek 7H9ADST olun. 4 ° C'de saklayın.
3. kanamisin sülfat, 50 mg tartılır ve deiyonize su içinde 1 mL içinde çözülür; son konsantrasyon 50 mg / mL'dir. Filtre ile sterilize edilir ve -20 ° C'de saklayın. 7H9ADST 1 L başına stok solüsyonu kanamisin 0.5 mL ekleyin.
   Bu ortam, taze yapılmalıdır, bu nedenle kültür büyüklüğüne göre uygun hacimleri ölçek: NOT.
4. 7H'da M. tuberculosis büyütün9ADST kültüründe kanamisin ile takviye edilmiştir. Günlük kültürünü çalkalayın ve OD600 kümelenmeyi önlemek 1,0 ulaşmadan önce seyreltin.
   NOT: Bu yöntemin geliştirilmesi için kullanılan, M. tuberculosis türü H37Rv pJAK2.A plazmid ¹² ile transforme edilmiştir. pJAK2.A hsp60 promotörü 'dan ateş böceği lusiferaz geninin yüksek düzeyde ifade edilmesini sağlayan ve kanamisin kullanılarak seçilebilir pMV361 vektörü göre entegre bir plazmiddir.

2. THP-1 Orta ve Bakım

1. RPMI tam olmayan ortam (yaklaşık% 10 FBS ve 2 mM glutamin) yapmak için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve RPMI 1640, 500 mL, 200 mM L-glutamin, 5 mL, 50 mL ekleyin.
2. Standart protokol ¹³ uyarınca bir THP-1 hücre kültürünün muhafaza edin. pas arasındaki ortamın mL başına 1 milyon 0.2 bir hücre yoğunluğuna korurken Kısaca, RPMI tam olmayan bir ortam içinde, THP-1 hücreleri büyütmekBilgeler.

3. Yüksek verim Hücre içi Eleme Lusiferaz ifade eden M. tuberculosis H37Rv'den kullanma

1. 600 nm bir dalga boyunda bir spektrofotometre aktif olarak büyüyen bir bakteri süspansiyonu optik yoğunluk ölçülür. ML başına 0.1 _OD600 = 3 x 10 ⁷ bakteri dönüştürme faktörü kullanılarak bakteriyel yoğunluğa hesaplayın.
2. Yeni bir santrifüj tüpü içine 1: enfeksiyon, 10 (MOI) bir çokluğu için yeterli bakterileri Pipet. 10 dakika boyunca 3000 x g'de Pelet ve sıvı aspire. RPMI1640 450 uL insan serumu, 50 uL ekleyin. Deney için değerleri uygun kaynaklarına hacmini Ölçek.
3. Bakteri opsonize için,% 10 insan serumu içeren RPMI1640 500 uL başına 1 x 10 ⁸ bakteri yoğunluğunda pelletini. Karışım 30 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkada bırakın. Bir hemasitometre ve ters mikroskobik ile sayma ile THP-1 hücre kültürü yoğunluğunun belirlemepe.
4. 100 xg steril santrifüj tüplerinde pelet hücreleri ve 10 dakika için 37 ° C. Süpernatant aspire ve eksik mL için 1 milyon hücre yoğunluğunda RPMI hücreleri tekrar süspansiyon. 40 ng / ml nihai konsantrasyona, forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ekleyin.
   NOT: Bu farklılaşma karışımı olarak anılacaktır.
5. 10 MOI'de THP-1 farklılaşma karışımı ile opsonize M. tuberculosis birleştirin: 1 ve bir 96-gözlü düz dipli beyaz plaka oyuk başına 100 uL nihai karışım kısım. Düzenli bütünlüğü sağlamak için karışım karıştırılır. Farklılaşma ve enfeksiyon,% 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de gece boyunca devam izin verin.
6. RPMI her 100 uL kuyular iki kere yıkayın. Eksik RPMI içinde arzu edilen konsantrasyonlara kadar seyreltildi bileşikler ilave edin ve 3 gün inkübe edilir.
7. kuyu ortamı aspire. Her kuyuya lusiferaz deneme ayıracı 50 mcL ekleyin. t plakaları sızdırmazransparent yapışkan plaka ayırıcılar. 22 ° C'de inkübasyondan 5 dakika bekleyin, daha sonra 1 saniye bir luminometrede bir okuma elde etmek ile sabitleştirilir.

4. Sitotoksisite Analizi: 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromit (MTT) kullanılarak Deney ¹⁴

1. RPMI içinde, THP-1 hücreleri ayırt eksik açık 96 oyuklu plakalar içinde PMA 40 ng / ml ile takviye edilmiştir. Hücre mL başına 1 milyon yoğunluğu ve kısım oyuk başına 100 uL koruyun. Farklılaşma,% 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de gece boyunca devam izin verin.
2. çukurlara eksik RPMI içinde seyreltilmiş bileşikler ekleme kuyulardan orta aspire edilmiş ve RPMI 1640 ile iki kez yıkayın. 3 gün boyunca inkübe.
3. 5 mg / mL'lik bir stok çözelti yapmak için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 100 mL MTT 0.5 g eritin. uzak ışık -20 ° C'de steril filtre ve depolamak; Bu çözüm, taze hale getirmek için en iyisidir.
4. 2.5 saat beforE 3 günlük kuluçka süresinin sonunda, her bir göze MTT çözeltisi 25 mcL ve kuluçka dönemi doldurun.
5. % 50 N hazırlanması, N-dimetil formamid (DMF), deiyonize su, 250 mL DMF, 250 mL karıştırılarak.
6. aşağıdaki şekilde MTT ekstraksiyon tamponu hazırlayın: 500 mL'lik bir şişe içinde SDS 100 g tartılır ve% 50 DMF ve 300 ml. SDS ile erimesi için düşük ısı uygulayın. Saf asetik asit içinde 10 mL 1 M HCI 12.5 mL ekleyin. % 50 DMF ile 500 ml işaretine kadar doldurmak; ekstraksiyon tamponu nihai bileşimin% 50 DMF,% 20 SDS,% 2.5 asetik asit ve% 2.5 1 M hidroklorik asittir.
7. Tedavi süresinin sonunda, her bir göze (herhangi bir kristallerin çözünmesi için 45 ° C'ye kadar ısıtıldı), öz çıkarma tamponu içerisinde 100 uL ilave edin. Karışım, 37 ° C'de gece boyunca inkübe izin verin % 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde ° C. 570 nm de absorbans okuyunuz.
   NOT: sitotoksisite deneyi iyi bir hücreler arası paralel olarak gerçekleştirilirTHP-1 hücrelerinin, aynı kesikli ve yaş ile ular ekranı.

5. In-suyu Aktivite Analizi Bir Resazurin Deney ³ kullanma

1. Orta log fazı (- 0.8 OD ₆₀₀ ~ 0.5) 7H9ADST M. tuberculosis büyütün. 0.01 OD ₆₀₀ 7H9ADST ile kültür seyreltin. her bir her bir seyreltilmiş bileşik test konsantrasyonları ve kısım 100 uL 2x 7H9ADST bileşikleri seyreltin.
2. Her kuyuya seyreltilmiş bakteri süspansiyonu 100 uL aktarın. Plakalar 5 gün için nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de kuluçkada bırakın. iyonu giderilmiş su ve steril filtre 100 mL resazurin 10 mg çözülür.
3. 30 uL resazurin çözeltisi ekleyin ve 48 saat sonra renk değişikliği izlemek; Bakteri üremesi pembe mavi bir renk dönüşümü ile gösterilir.
   NOT: nicel analizi de 530 eksıtasyonla 590 nm'de floresans, ya ölçülerek yapılabilir - 560nm ya da 570 nm 'de absorbans 600 nm ile ¹⁵ nm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Lüsiferaz genini M. tüberküloz kullanan yüksek çıktılı hücre içi tarama

Şekil 2A ve Tablo 1 luminometre ile toplanmış ham veriler, THP-1 hücreleri içinde M. tuberculosis ile TB ilaç rifampisin artan konsantrasyonunun etkisini gösteren, nispi ışık saçan birimleri (RLU) olarak ifade içerir. Şekil 2A, rifampisin, çeşitli konsantrasyonları ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, M. tuberculosis için bir insan hücre içi enfeksiyon modeli kullanılarak basit ve düşük maliyetli HTS yöntemini yaratmaktı. Tüberküloz, M. tuberculosis ile alveoler makrofajların enfeksiyonu ile karakterize edilen bir insan hastalıktır. Nedeniyle bio, bakteri ve konak hücrelerin hem biyolojik modellerini kapsayan araştırma, geçmişte kullanılmıştır. Ancak, vekil bakteri ve insan olmayan modellerin kullanımı ilaç tarama iyi M. tuberculosis

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717