Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Resumen

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Resumen

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introducción

Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis (TB), es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. TB-Drogas sensible es una enfermedad tratable que requiere múltiples antibióticos para un período de 6 meses. A pesar de ser una enfermedad tratable, la mortalidad por tuberculosis se estimó en 1,5 millones en 2015 ^1. En los últimos 10 años, han aumentado las preocupaciones sobre la prevalencia de resistente a los medicamentos M. tuberculosis. Multirresistente TB (MDR-TB) se define como la tuberculosis que es resistente a al menos isoniazida (INH) y la rifampicina (RMP), y la mayoría de las cepas MDR-TB son también resistentes para seleccionar fármacos antituberculosos de segunda línea, lo que limita las opciones de tratamiento . Los efectos de la resistencia a los medicamentos crean un mayor desafío para el tratamiento de pacientes coinfectados con virus de inmunodeficiencia humana (VIH); 400.000 pacientes en todo el mundo murieron de tuberculosis asociada al VIH en 2015 ^1. Lamentablemente, los Estados Unidos de Alimentos y Medicamentos Administración ha aprobado sólo un nuevo medicamento contra la tuberculosis MDR-TB, bedaquiline, en los últimos 40 años ^2. Se necesitan con urgencia los avances en la búsqueda de mejores y más cortas las terapias de TB con el fin de mantenerse a la vanguardia en la lucha contra la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente.

Tradicionalmente, las pantallas de drogas TB se llevan a cabo en condiciones de crecimiento in vitro en medio de crecimiento, con lo que se añaden compuestos a un cultivo en crecimiento y de su eficacia en la erradicación de los microorganismos se determinó por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en medio sólido. Como recuentos de CFU requieren mucho trabajo, mucho tiempo, y costoso, diversos métodos indirectos se han desarrollado para aliviar este problema. Tales métodos incluyen el ensayo Alamar Blue viabilidad ^3, la determinación de la fluorescencia ⁴ de la proteína verde fluorescente (GFP) o luminiscencia ⁵ a partir de bacterias de luciferasa que expresan, y la estimación de la adenosina trifosfato total de (ATP) ^{6, 7.}

TB típica se caracteriza por una infección por M. tuberculosis del pulmón, donde las bacterias residen y se replican dentro de las fagosomas de los macrófagos alveolares ^8. El simple pantalla fenotípica en caldo puede adaptarse a los patógenos extracelulares; sin embargo, en la perspectiva histórica, golpean compuestos contra M. tuberculosis identificados mediante este método a menudo no logran cumplir con las expectativas durante las etapas de validación aguas abajo en modelos de infección. Proponemos que los medicamentos antituberculosos se realiza mejor en un modelo de infección de la célula huésped intracelular. Sin embargo, los modelos intracelulares poseen muchas barreras tecnológicas y biológicas a screening (HTS) el desarrollo de alto rendimiento. Un gran obstáculo es la complejidad del proceso de infección, ejemplificada por numerosos pasos y el elaborado eliminación de bacterias extracelulares en el medio de lavado. Un segundo obstáculo importante es el largo tiempo de requirements, como la detección de crecimiento, normalmente realizado por CFU contando en placas de cultivo, es un proceso que toma más de 3 semanas en completarse. Una solución para reemplazar los recuentos de CFU ha sido proporcionada por microscopía fluorescente automatizado en combinación con las bacterias fluorescentes. Sin embargo, esta solución requiere una inversión inicial del equipo que está fuera del alcance de muchos laboratorios de investigación. A simple, de bajo costo, y el método HTS-enfermedad pertinente mejoraría en gran medida el proceso de descubrimiento de fármacos.

En este estudio, se presenta un nuevo sistema, HTS modular que está dirigido a proporcionar un rápido y altamente escalable, con todo económica, ensayo adecuado para determinar la actividad de los compuestos contra M. tuberculosis intracelular. Este sistema se compone de tres módulos: (i) intracelular, (ii) la citotoxicidad, y (iii) ensayos in-caldo. El resultado final combinado proporciona una descripción completa de las propiedades del compuesto, con información adicional en cuanto al modo de acción potencial. este SCsistema reening se ha utilizado en varios proyectos con diversas bibliotecas de compuestos que modo de acción objetivo, incluyendo el análisis de la sinergia de drogas ^9, la estimulación de la autofagia ^10, y la inhibición de M. tuberculosis -secreted factor de virulencia (no publicado). Los compuestos de modo de acción desconocido también se han estudiado ^11. Una versión modificada de este método fue también adoptado por nuestro socio industrial como método de cribado primario de identificar nuevos compuestos contra intracelular M. tuberculosis ^11.

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Protocolo

1. cepa bacteriana y el medio de crecimiento

1. Hacer dextrosa albúmina y solución de sal de stock (ADS) por solubilización de 25 g de albúmina de suero bovino, 10,0 g de dextrosa, y 4,05 g de cloruro de sodio en 460 ml de agua desionizada. Filter-esterilizar el ADS y almacenar a 4 ° C.
2. Hacer caldo 7H9 mediante la adición de 4,7 g de 7H9 en polvo y 2 ml de glicerol a 900 ml de agua purificada. Autoclave el caldo 7H9 a 121 ° C durante 10 min y permitir que se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder. Hacer 7H9ADST mediante la adición de 100 ml de ADS y 0,5 ml de Tween 80 a 900 ml de caldo 7H9. Almacenar a 4 ° C.
3. Pesar 50 mg de sulfato de kanamicina y se disuelven en 1 ml de agua desionizada; la concentración final es de 50 mg / mL. Filter-esterilizar y almacenar a -20 ° C. Añadir 0,5 ml de kanamicina solución madre por 1 L de 7H9ADST.
   NOTA: Este medio debe hacerse fresco, así escalar los volúmenes apropiadamente de acuerdo con el tamaño cultura.
4. Crecer M. tuberculosis en 7H9ADST suplementado con kanamicina en pie cultura. Agitar la cultura diaria y diluir antes de que la DO600 alcanza 1,0 para evitar la formación de grumos.
   NOTA: La cepa de M. tuberculosis utilizado para el desarrollo de este método fue H37Rv transformó con pJAK2.A plásmido ^12. pJAK2.A es un plásmido integrativo basado en el vector pMV361, que permite la expresión de alto nivel del gen de la luciferasa de luciérnaga a partir del promotor hsp60 y se pueden seleccionar utilizando kanamicina.

2. THP-1 Medium y mantenimiento

1. Añadir 50 ml de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS) y 5 ml de 200 mM de L-glutamina a 500 ml de RPMI 1640 para hacer RPMI medio incompleto (aproximadamente 10% de FBS y glutamina 2 mM).
2. Mantener un cultivo de células THP-1 según el protocolo estándar de ^13. Brevemente, crecer células THP-1 en medio RPMI incompleto mientras se mantiene una densidad celular de 0,2 a 1 millón por ml de medio de entre passabios.

3. Alto rendimiento Screening intracelular Uso de luciferasa que expresan M. tuberculosis H37Rv

1. Medir la densidad óptica de una suspensión bacteriana en crecimiento activo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Calcular la densidad bacteriana usando el factor de conversión de 0,1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ bacterias por ml.
2. Pipeta de las bacterias suficientes para una multiplicidad de infección (MOI) de 10: 1 en un nuevo tubo de centrífuga. Se precipitan a 3.000 xg durante 10 min y aspirar el líquido. Añadir 50 l de suero humano a 450 l de RPMI1640. Escala el volumen de apropiarse de los valores para el experimento.
3. Para opsonizar las bacterias, resuspender el precipitado a una densidad de 1 x 10 ⁸ bacterias por 500 l de RPMI1640 que contiene suero humano al 10%. Dejar que la mezcla se incuba a 37 ° C durante 30 min. Determinar la densidad de cultivo de células THP-1 mediante el recuento con un hemocitómetro y un microsco invertidaEducación física.
4. Sedimentar las células en tubos de centrífuga estériles a 100 xg y 37 ° C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI incompleto a una densidad de 1 millón de células por ml. Añadir forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) a una 40 ng / ml de concentración final.
   NOTA: Esto se conoce como la mezcla diferenciación.
5. Combinar opsonizado M. tuberculosis con THP-1 mezcla diferenciación a una MOI de 10: 1 y alícuota la mezcla final a 100! L por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano. Regularmente se agita la mezcla para asegurar la uniformidad. Permitir a la diferenciación y la infección de proceder durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de _CO2.
6. Lavar los pocillos dos veces con 100! L de medio RPMI cada uno. Añadir compuestos diluidos a las concentraciones deseadas en RPMI incompleto e incubar durante 3 días.
7. Aspirar el medio de los pocillos. Añadir 50 l de reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo. Sellar las placas con tRansparent selladores de placas adhesivas. Permitir 5 min de incubación a 22 ° C y luego obtener una lectura en un luminómetro en 1 s por pocillo.

4. Análisis de citotoxicidad El uso de un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) Ensayo ¹⁴

1. Diferenciar las células THP-1 en medio RPMI incompleto suplementado con 40 ng / ml de PMA en claras placas de 96 pocillos. Mantener una densidad celular de 1 millón por ml y alícuota de 100 l por pocillo. Permitir la diferenciación de proceder durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de _CO2.
2. Aspirar el medio de los pocillos y lavar dos veces con RPMI 1640. Añadir compuestos diluidos en medio RPMI incompleto a los pocillos. Incubar durante 3 días.
3. Disolver 0,5 g de MTT en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una solución madre de 5 mg / mL. Filtro estéril y se almacena a -20 ° C, lejos de la luz; lo mejor es hacer que esta solución fresca.
4. 2,5 h se acabene el final del período de incubación de 3 días, se añaden 25 l de solución de MTT a cada pocillo y completar el período de incubación.
5. Preparar 50% de N, N -dimetil formamida (DMF) mediante la mezcla de 250 ml de DMF con 250 ml de agua desionizada.
6. Preparar tampón de extracción MTT como sigue: Pesar 100 g de SDS en una botella de 500 ml y añadir 300 ml de DMF al 50%. Aplicar calor suave para permitir que el SDS se disuelva. Añadir 10 ml de ácido acético puro y 12,5 ml de HCl 1 M. Llenar hasta la marca de 500 ml con 50% de DMF; la composición final de tampón de extracción es de 50% de DMF, 20% de SDS, ácido acético 2,5%, y 2,5% de ácido clorhídrico 1 M.
7. Al final del período de tratamiento, añadir 100 l de tampón de extracción (calentado a 45 ° C para disolver cualquier cristales) a cada pocillo. Dejar que la mezcla se incuba durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de _CO2. Leer la absorbancia a 570 nm.
   NOTA: El ensayo de citotoxicidad se realiza mejor en paralelo con un intracelularpantalla ular usando el mismo lote y la edad de las células THP-1.

5. En caldo Actividad análisis utilizando un resazurina Ensayo ³

1. Crecer M. tuberculosis en 7H9ADST a la fase semilogarítmica (~ 0,5-0,8 OD _600). Diluir el cultivo con la 7H9ADST a 0,01 OD _600. Diluir los compuestos en 7H9ADST a 2x las concentraciones de ensayo y alícuota de 100 l de cada compuesto diluido en cada pocillo.
2. Transferir 100 l de la suspensión bacteriana diluida en cada pocillo. Permitir a las placas incubar a 37 ° C en un incubador humidificado durante 5 días. Disolver 10 mg de resazurina en 100 ml de agua desionizada y el filtro estéril.
3. Añadir 30 l de solución de resazurina y controlar el cambio de color después de 48 h; el crecimiento bacteriano se indica mediante una conversión de color de azul a rosa.
   NOTA: Un análisis cuantitativo también se puede realizar mediante la medición de ya sea la fluorescencia a 590 nm con excitación a 530 hasta 560nm o la absorbancia a 570 nm y 600 nm ^15.

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Resultados

Detección intracelular de alto rendimiento usando M. tuberculosis que expresa el gen de la luciferasa

La figura 2A y en la Tabla 1 contienen los datos brutos recogidos por el luminómetro, expresados en unidades luminiscentes relativas (RLU), que muestra el efecto de una concentración creciente de la rifampicina fármaco TB en M. tuberculosis dentro de las células THP-1.

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Discusión

El objetivo de este estudio fue la creación de una forma sencilla y rentable método HTS usando un modelo de infección intracelular humano para M. tuberculosis. La tuberculosis es una enfermedad humana caracterizada por la infección de los macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Debido a cuestiones de bioseguridad, la investigación con modelos biológicos, tanto de la bacteria y las células huésped se ha utilizado en el pasado. Sin embargo, se ha demostrado que el uso de bacterias portadoras ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717