細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

要約

我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。

要約

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

概要

結核菌 、結核（TB）の原因物質は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。薬物感受性TBは、6ヶ月の期間にわたって複数の抗生物質を必要とする治療可能な疾患です。治療可能な疾患であるにもかかわらず、結核死亡率は、2015年¹における150万と推定されました。過去10年間で、薬剤耐性結核の有病率に対する懸念が高まっています。多剤耐性結核（MDR-TB）は、少なくともイソニアジド（INH）、及びリファンピシン（RMP）、最もMDR-TB株は、このように治療の選択肢を制限する、第二のラインTB薬を選択することも耐性があるに耐性のあるTBのように定義されます。薬剤耐性の効果は、患者のヒト免疫不全ウイルス（HIV）で同時感染を治療するために大きな課題を作成します。 40万患者は世界中で2015 ¹でHIV関連結核で死亡しました。残念なことに、米国食品医薬品Administ配給は、過去40年間²に、MDR-TB、bedaquilineに対する唯一の新しい結核治療薬を承認しました。より良いと短いTBの治療法を見つけるの進歩が緊急TBとMDR-TBとの戦いに先に滞在するために必要とされています。

伝統的に、TB薬物スクリーニングは、化合物が成長している培養物に添加し、微生物を根絶におけるそれらの有効性は、固体培地上のコロニー形成単位（CFU）をカウントすることによって決定されることにより、増殖培地中でインビトロ増殖条件下で行われます。 CFU数は労働集約的、時間がかかり、かつ高価であるように、様々な間接的な方法は、この問題を軽減するために開発されています。そのような方法は、アラマーブルー生存率アッセイ^3、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェラーゼを発現する細菌からの発光⁵からの蛍光⁴の決意、および全アデノシン三リン酸の推定（Aを含みます^{TP）6、7。}

典型的なTBは、細菌は肺胞マクロファージ⁸のファゴソーム内部に存在し、複製肺の結核菌の感染によって特徴付けられます。シンプルな中ブロス表現型の画面は、細胞外病原体に合うこと。しかし、歴史的な観点では、この方法を用いて同定された結核菌に対する化合物は、多くの場合、感染モデルにおける下流の検証ステップの間、期待に応えるに失敗ヒット。私たちは、結核治療薬は、最高の細胞内宿主細胞の感染モデルで実行されていることを提案します。それにも関わらず、細胞内のモデルは、ハイスループットスクリーニング（HTS）の開発に多くの技術および生物学的障壁を保有します。大きなハードルは多くの工程と洗浄の間で-による細胞外細菌の精巧な除去によって例示される、感染プロセスの複雑さです。第二の主要なハードルは、長い時間の再ですquirementsは、通常CFU培養プレート上でカウントすることによって行わ増殖検出として、完了するまでに3週間以上を要するプロセスです。 CFUカウントを交換する1つの解決策は、蛍光細菌との組み合わせで自動化された蛍光顕微鏡によって提供されています。しかし、この解決策は、多くの研究室のための手の届かないところにある初期の設備投資が必要となります。シンプル、低コスト、および疾患関連HTS方法を大幅に創薬プロセスを高めるであろう。

本研究では、細胞内の結核菌に対する化合物の活性を決定するのに適した、迅速、かつ拡張性の高い、まだ経済的、アッセイを提供することを目的とする新しい、モジュラーHTSシステムを報告しています。 （I）細胞内、（ii）の細胞毒性、および（iii）中のブロスアッセイ：このシステムは、三つのモジュールから構成されています。合わせた最終的な結果は、作用の潜在的なモードなどの追加情報と、化合物の特性の包括的な説明を提供します。このSCreeningシステムは、薬物相乗作用⁹の分析、オートファジー¹⁰の刺激、および結核菌 -secreted毒性因子（未発表）の阻害を含む作用機序を標的とする様々な化合物ライブラリー、といくつかのプロジェクトで使用されてきました。アクションの未知のモードの化合物はまた^、11を研究されています。この方法の修正版は、細胞内結核菌 ¹¹に対して新規な化合物を同定するための一次スクリーニング法としての産業パートナーによって採択されました。

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プロトコル

1.菌株および増殖培地

1. ウシ血清アルブミン、デキストロース10.0gを、脱イオン水の460 mLの塩化ナトリウムの4.05グラムの25グラムを溶解することによってアルブミンデキストロースおよび塩のストック溶液（ADS）を作ります。 4℃でのADS及びストアをフィルター滅菌します。
2. 7H9粉末4.7gの精製水900 mLでのグリセロールの2ミリリットルを添加することにより、7H9ブロスを作ります。 10分間121℃で7H9ブロスをオートクレーブし、それが進行する前に、室温まで冷却することを可能にします。 ADS 100mLおよび7H9ブロス900mLのにTween80を0.5ミリリットルを添加することによって7H9ADSTを作ります。 4°Cで保存。
3. 硫酸カナマイシン50mgを秤量し、脱イオン水1mLに溶解します。最終濃度は50mg / mLです。フィルター滅菌し、-20℃で保存。 7H9ADSTの1リットル当たりのカナマイシンストック溶液0.5mlを加えます。
   注：この培地はとてもボリュームを拡張適切培養サイズに応じて、新鮮されるべきです。
4. 7Hに結核菌を育てます9ADSTは文化を立っ中でカナマイシンを補いました。毎日文化を振ると、OD600が凝集を避けるために、1.0に到達する前にそれを希釈します。
   注：この方法の開発のために使用されるヒト結核菌株は、菌H37Rv pJAK2.Aプラスミド¹²で形質転換しました。 pJAK2.Aは、HSP60プロモーターからホタルルシフェラーゼ遺伝子の高レベル発現を可能にし、カナマイシンを使用して選択することができるpMV361ベクターに基づく組込みプラスミドです。

2. THP-1培地とメンテナンス

1. （FBSおよび2mMグルタミン約10％）RPMI不完全培地を作製するために、熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）の50 mLおよびRPMI 1640を500mLの200mMのL-グルタミンを5mLを加えます。
2. 標準的プロトコール¹³に従ってTHP-1細胞の培養を維持します。 PASの間に0.2培地1mL当たり100万の細胞密度を維持しながら簡単に説明すると、RPMI不完全培地中のTHP-1細胞を増殖させます賢人。

ルシフェラーゼ発現ヒト結核菌H37Rvを用い3.ハイスループット細胞内スクリーニング

1. 波長600nmで分光光度計で活発に増殖する細菌懸濁液の光学密度を測定します。ミリリットル当たり0.1 OD ₆₀₀ = 3×10 ⁷細菌の換算係数を使用して、細菌密度を計算します。
2. 新しい遠心管に10：1の感染の多重度のために十分な細菌（MOI）を行うピペット。 10分間3,000×gでペレット化し、液体を吸引。 RPMI1640の450μLにヒト血清の50μLを追加します。実験の値を適切にするボリュームをスケール。
3. 細菌をオプソニン化するために、10％ヒト血清を含有するRPMI1640 500μLあたり1×10 ⁸の細菌の密度でペレットを再懸濁します。混合物を30分間37℃でインキュベートすることを可能にします。血球計および反転microscoで計数することによりTHP-1細胞の培養密度を決定PE。
4. 100×gでの滅菌遠心管中の細胞をペレット化し、10分間37°C。上清を吸引し、ミリリットル当たり100万個の細胞の密度で、不完全RPMI中に細胞を再懸濁。 40 / mlの最終濃度までホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）を加えます。
   注：これは分化ミックスと呼ぶことにします。
5. オプソニン化結核菌は、10のMOIでのTHP-1分化混合物と結合：1、96ウェル平底白色プレートにウェル当たり100μLの最終ミックスのアリコート。定期的に均一性を確保するために、混合物を攪拌。分化および感染は5％CO _2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。
6. RPMI各100μLでウェルを2回洗浄します。不完全RPMI中で所望の濃度に希釈した化合物を添加し、3日間インキュベートします。
7. ウェルから培地を吸引除去します。各ウェルにルシフェラーゼアッセイ試薬の50μLを追加します。 Tでプレートをシールransparent接着プレートシーラー。 22℃でのインキュベーションの5分を許可した後、ウェルあたり1秒でルミノメーターで読み出しを得ます。

3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ^14を使用4.細胞毒性分析

1. 不完全な透明な96ウェルプレートにPMAの40 / mlのを補充したRPMI中でTHP-1細胞に分化します。ウェル当たりミリリットル当たり100万、アリコート100μLの細胞密度を維持します。分化は、5％のCO _2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。
2. ウェルに不完全なRPMIで希釈した化合物を加えるウェルから培地を吸引除去し、RPMI 1640で二回洗って。 3日間インキュベートします。
3. 5mg / mlのストック溶液を作製するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）100mLにMTT 0.5gを溶かします。離れた光から-20℃で滅菌フィルターとストア、。それは、このソリューションは、新鮮な作るのがベストです。
4. 2.5時間beforE 3日間の潜伏期間の終わりには、各ウェルにMTT溶液25μLを追加し、潜伏期間を完了します。
5. 50％のNを準備し、N個のジメチルホルムアミド（DMF）250mLの脱イオン水とDMFの250ミリリットルを混合することによって。
6. 次のようにMTT抽出緩衝液を調製：500mLの瓶にSDSを100gを秤量し、50％のDMF 300 mLを加え。 SDSを溶解させるために、低熱を適用します。純粋な酢酸10mlおよび1MのHCl 12.5 mLを加え。 50％のDMFと500mLのマークに埋めます。抽出緩衝液の最終組成は、50％DMF、20％SDS、2.5％酢酸、2.5％1 M塩酸です。
7. 処置期間の終わりに、各ウェルに（任意の結晶を溶解するために45℃に加温し）抽出緩衝液100μLを加えます。混合物を37で一晩インキュベートすることを許可します 5％CO ₂を含む加湿インキュベーター内℃です。 570 nmの吸光度を読みます。
   注：細胞毒性アッセイは、最良のセル内と並行して行われますウラル画面THP-1細胞の同じバッチと年齢を使用しました。

レサズリンアッセイ^3を使用して、ブロス活性分析5.

1. （ - 0.8 OD _600〜0.5）対数中期に7H9ADSTに結核菌を成長させます。 0.01 OD ₆₀₀に7H9ADSTと文化を希釈します。各ウェルに各希釈した化合物の試験濃度及びアリコート100μLを2倍する7H9ADSTで化合物を希釈します。
2. 各ウェルに希釈した細菌懸濁液100μLを移します。プレートを5日間、加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートすることを可能にします。脱イオン水および滅菌フィルタ100mLにレサズリン10mgを溶解します。
3. レサズリン溶液を30μLを加え、48時間後に色の変化を監視します。細菌増殖はピンクに青から色変換によって示されます。
   注：定量分析もまた530での励起と共に、590nmでの蛍光のいずれかを測定することによって行うことができる - 560nMもしくは570 nmの吸光度と600nmで^15。

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結果

ルシフェラーゼ遺伝子を発現結核菌を用いた高スループットの細胞内スクリーニング

図2Aと表1はルミノメーターによって収集された生データを含む、THP-1細胞内の結核菌に対するTB薬物リファンピシンの濃度の増加の効果を示し、相対発光単位（RLU）で表しました。 図2Aは、

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ディスカッション

本研究の目標は、 結核菌のための人間の細胞内感染モデルを使用して、シンプルでコスト効率のHTS方法を作成することでした。結核は、 結核菌によって肺胞マクロファージの感染によって特徴付けられるヒト疾患です。バイオセーフティ問題に、細菌と宿主細胞の両方の生物学的モデルを含む研究は過去に使用されてきました。しかし、サロゲート細菌および非ヒトモデルの?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717