Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Résumé

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Résumé

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, l'agent causal de la tuberculose (TB), est une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. TB sensible aux drogues est une maladie traitable qui nécessite de multiples antibiotiques pour une période de 6 mois. En dépit d' être une maladie curable, la tuberculose mortalité a été estimée à 1,5 million en 2015 ^1. Au cours des 10 dernières années, il y a eu des préoccupations croissantes quant à la prévalence de la tuberculose M. pharmacorésistante. TB multirésistante (MDR-TB) est définie comme la tuberculose qui est résistante à au moins l'isoniazide (INH) et rifampicine (RMP), et la plupart des souches de MDR-TB sont également résistantes à sélectionner des médicaments antituberculeux de deuxième ligne, limitant ainsi les options de traitement . Les effets de la résistance aux médicaments créent un plus grand défi pour le traitement des patients co-infectés par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH); 400.000 patients dans le monde sont morts de la tuberculose associée au VIH en 2015 ^1. Il est décevant, la Food and Drug États-Unis Administration a approuvé un seul nouveau médicament contre la tuberculose MDR-TB, bédaquiline, au cours des 40 dernières années ^2. Les progrès dans la recherche de meilleures thérapies et de la tuberculose plus courtes sont nécessaires de toute urgence afin de rester en tête dans la lutte contre la tuberculose et la tuberculose multirésistante.

Traditionnellement, les écrans de médicaments antituberculeux sont effectuées sous des conditions in vitro de la croissance dans un milieu de croissance, de sorte que les composés sont ajoutés à une culture en croissance et de leur efficacité dans l' élimination des micro - organismes sont déterminés en comptant les unités formant des colonies (CFU) sur un milieu solide. Comme UFC compte sont chronophage intensifs, la main-d'œuvre, et coûteuse, diverses méthodes indirectes ont été développées pour remédier à ce problème. Ces procédés comprennent le dosage de viabilité Alamar Bleu ^3, la détermination de la fluorescence à partir de ⁴ protéine fluorescente verte (GFP) ou la luminescence ⁵ à partir de bactéries exprimant la luciférase, et l'estimation de l' adénosine triphosphate totale (ATP) ^{6, 7.}

TB typique est caractérisée par une infection par M. tuberculosis du poumon, où les bactéries se trouvent et se répliquent à l' intérieur des phagosomes des macrophages alvéolaires ^8. L'écran phénotypiques simple bouillon peut convenir à des agents pathogènes extracellulaires; Cependant, dans la perspective historique, ont frappé des composés contre M. tuberculosis identifiés en utilisant cette méthode ne parviennent souvent pas à la hauteur des attentes au cours des étapes de validation en aval dans les modèles d'infection. Nous proposons que médicaments contre la tuberculose est mieux réalisée dans un modèle d'infection de la cellule hôte intracellulaire. Néanmoins, les modèles intracellulaires possèdent de nombreux obstacles technologiques et biologiques au développement de criblage à haut débit (HTS). Un grand obstacle est la complexité du processus d'infection, illustrée par de nombreuses étapes et l'élimination complexe de bactéries extracellulaires par lavage entre-deux. Un deuxième obstacle majeur est le long temps requirements, comme la détection de la croissance, normalement effectuée par comptage CFU sur les plaques de culture, est un processus qui prend plus de 3 semaines. Une solution pour remplacer CFU chiffres a été fournie par microscopie à fluorescence automatisée en combinaison avec des bactéries fluorescentes. Cependant, cette solution nécessite un investissement initial de l'équipement qui est hors de portée pour de nombreux laboratoires de recherche. Un simple, à faible coût, et la méthode de HTS pertinente maladie améliorerait considérablement le processus de découverte de médicaments.

Dans cette étude, nous présentons un nouveau système modulaire qui HTS vise à fournir une réponse rapide et hautement évolutive, mais économique, dosage approprié pour déterminer l'activité des composés contre intracellulaire M. tuberculosis. Ce système est composé de trois modules: (i) intracellulaire, (ii) la cytotoxicité, et (iii) des essais in-bouillon. Le résultat final combiné fournit une description complète des propriétés du composé, avec des informations supplémentaires quant au mode d'action potentiel. cette scSystème écologisation a été utilisé dans plusieurs projets avec diverses banques de composés qui ciblent le mode d'action, y compris l'analyse de la synergie des médicaments ^9, la stimulation de l' autophagie ^10, et l'inhibition de M. tuberculosis -secreted facteur de virulence (non publié). Les composés de mode d'action inconnu ont également été étudiés ^11. Une version modifiée de cette méthode a également été adoptée par notre partenaire industriel comme la principale méthode de criblage pour identifier de nouveaux composés contre la tuberculose intracellulaire M. ^11.

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Protocole

1. La souche bactérienne et la croissance moyenne

1. Faire dextrose albumine et solution de réserve de sel (ADS) en solubilisant 25 g d'albumine de sérum bovin, 10,0 g de dextrose et 4,05 g de chlorure de sodium dans 460 ml d'eau déminéralisée. Filtre-stériliser l'ADS et stocker à 4 ° C.
2. Ajouter le bouillon 7H9 en ajoutant 4,7 g de poudre 7H9 et 2 ml de glycerol à 900 mL d'eau purifiée. Autoclaver le bouillon 7H9 à 121 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir à la température ambiante avant de procéder. Faire 7H9ADST en ajoutant 100 ml d'ADS et 0,5 ml de Tween80 à 900 ml de bouillon 7H9. Conserver à 4 ° C.
3. Peser 50 mg de sulfate de kanamycine et on dissout dans 1 ml d'eau déminéralisée; la concentration finale est de 50 mg / mL. Filtre-stériliser et stocker à -20 ° C. Ajouter 0,5 ml de kanamycine solution mère par 1 L de 7H9ADST.
   NOTE: Ce milieu doit être frais, si les volumes échelle appropriée en fonction de la taille de la culture.
4. Cultivez M. tuberculosis dans 7H9ADST complété par la kanamycine dans la culture debout. Secouez la culture quotidienne et diluer avant la DO600 atteint 1,0 pour éviter agglomérante.
   NOTE: La souche de M. tuberculosis utilisé pour le développement de cette méthode a été H37Rv transformée avec le plasmide pJAK2.A ^12. pJAK2.A est un plasmide intégratif sur la base du vecteur pMV361, qui permet l' expression de haut niveau du gène de la luciférase de luciole à partir du promoteur hsp60 et peut être sélectionné en utilisant la kanamycine.

2. THP-1 moyen et entretien

1. Ajouter 50 ml de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (FBS) et 5 mL de 200 mM de L-glutamine à 500 ml de RPMI 1640 à faire milieu RPMI incomplète (environ 10% de FBS et 2 mM de glutamine).
2. Maintenir une culture de cellules THP-1 selon le protocole standard ^13. En bref, cultiver les cellules THP-1 dans du milieu RPMI incomplète, tout en maintenant une densité de cellules de 0,2 à 1 million par ml de milieu entre les passages.

3. Intracellulaire à haut débit utilisant le dépistage Luciferase exprimant M. tuberculosis H37Rv

1. Mesurer la densité optique d'une suspension de bactéries en croissance active dans un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 600 nm. Calculer la densité bactérienne en utilisant le facteur de conversion de 0,1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ bactéries par ml.
2. Pipeter les bactéries suffisantes pour une multiplicité d'infection (MOI) de 10: 1 dans un nouveau tube de centrifugation. Pellet à 3000 xg pendant 10 min et aspirer le liquide. Ajouter 50 pi de sérum humain à 450 pi de RPMI1640. Échelle du volume à des valeurs appropriées pour l'expérience.
3. Pour opsoniser les bactéries, resuspendre le culot à une densité de 1 x 10 ⁸ bactéries par 500 ul de RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain. Laisser le mélange à incuber à 37 ° C pendant 30 min. Déterminer la densité de la culture de cellules THP-1 par comptage avec un hémocytomètre et un microsco inversépe.
4. Pellet les cellules dans des tubes de centrifugation stériles à 100 xg et 37 ° C pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du RPMI incomplète à une densité de 1 million de cellules par ml. Ajouter phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) à une 40 ng / ml concentration finale.
   NOTE: Ce sera appelée mélange de différenciation.
5. Moissonneuse opsonisé M. tuberculosis avec le mélange de la différenciation de THP-1 à une MOI de 10: 1 et aliquoter le mélange final à 100 ul par puits dans une plaque blanche à 96 puits à fond plat. agiter régulièrement le mélange pour assurer l'uniformité. Permettent la différenciation et de l' infection à dérouler pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
6. Laver les puits deux fois avec 100 ul de RPMI chacun. Ajouter composés dilués aux concentrations souhaitées dans du RPMI incomplète et incuber pendant 3 jours.
7. Aspirer le milieu des puits. Ajouter 50 ul de réactif de dosage de luciférase à chaque puits. Sceller les plaques avec tscellants de plaques adhésives ransparent. Laisser 5 min d'incubation à 22 ° C, puis obtenir une lecture dans un luminomètre à 1 s par puits.

4. Analyse de cytotoxicité L' utilisation d' un acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) Dosage ¹⁴

1. Différencier les cellules THP-1 dans du milieu RPMI additionné de 40 incomplète ng / ml de PMA en clair des plaques à 96 puits. Maintenir une densité cellulaire de 1 million par ml et aliquote de 100 pi par puits. Permettre une différenciation de procéder pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
2. Aspirer le milieu des puits et les laver deux fois avec du RPMI 1640. Ajouter composés dilués dans du RPMI incomplète dans les puits. Incuber pendant 3 jours.
3. Dissoudre 0,5 g de MTT pour constituer une solution mère de 5 mg / mL 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Filtre stérile et conserver à -20 ° C, à l'abri de la lumière; il est préférable de faire de cette nouvelle solution.
4. 2,5 h BÉFORe la fin de la période d'incubation de 3 jours, ajouter 25 ul de solution de MTT à chaque puits et terminer la période d'incubation.
5. Préparer N 50%, N - diméthyl formamide (DMF) en mélangeant 250 ml de DMF avec 250 ml d'eau déminéralisée.
6. Préparer du tampon d'extraction MTT comme suit: Peser 100 g de SDS dans une bouteille de 500 ml et ajouter 300 ml de DMF à 50%. Appliquer à feu doux pour permettre au SDS de se dissoudre. Ajouter 10 ml d'acide acétique pur et 12,5 ml de 1 M HCl. Remplir jusqu'à la marque de 500 ml avec 50% de DMF; la composition finale du tampon d'extraction est de 50% de DMF, 20% de SDS, 2,5% d'acide acétique, et de 2,5% 1 M d'acide chlorhydrique.
7. A la fin de la période de traitement, ajouter 100 ul de tampon d'extraction (réchauffé à 45 ° C pour dissoudre tous les cristaux) dans chaque puits. Laisser le mélange à incuber pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2. Lire l'absorbance à 570 nm.
   NOTE: Le test de cytotoxicité est mieux réalisée en parallèle avec un intra-celluleécran Ular en utilisant même lot et l'âge des cellules THP-1.

5. Dans le bouillon Analyse d'activité à l' aide d' un dosage résazurine ³

1. Cultiver M. tuberculosis dans 7H9ADST à la phase mi-log (~ 0,5 à 0,8 DO _600). Diluer la culture avec le 7H9ADST à 0,01 DO _600. Diluer les composés dans 7H9ADST 2 fois les concentrations d'essai et aliquote de 100 uL de chaque composé dilué dans chaque puits.
2. Transférer 100 pl de la suspension bactérienne diluée dans chaque puits. Laisser les plaques à incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié pendant 5 jours. Dissoudre 10 mg de résazurine dans 100 mL d'eau désionisée et d'un filtre stérile.
3. Ajouter 30 pi de solution de résazurine et de surveiller le changement de couleur après 48 h; la croissance bactérienne est indiquée par une conversion de couleur du bleu au rose.
   NOTE: L'analyse quantitative peut également être effectuée soit par la mesure de la fluorescence à 590 nm avec une excitation à 530-560nm ou l'absorbance à 570 nm et 600 nm ^15.

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Résultats

Criblage intracellulaire à haut débit en utilisant M. tuberculosis exprimant le gène de la luciférase

La figure 2A et le tableau 1 contiennent les données brutes recueillies par le luminomètre, exprimés en unités luminescentes relatives (RLU), montrant l'effet d'une concentration croissante de la rifampicine aux antituberculeux de M. tuberculosis dans les cellule...

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Discussion

L'objectif de cette étude était de créer une méthode simple et rentable en utilisant un modèle HTS d'infection intracellulaire humaine pour M. tuberculosis. La tuberculose est une maladie humaine caractérisée par l'infection des macrophages alvéolaires par M. tuberculosis. En raison de problèmes de biosécurité, la recherche sur des modèles biologiques à la fois la bactérie et les cellules hôtes a été utilisé dans le passé. Cependant, il a été démontré que l'utilis...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717