מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Summary

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

שחפת Mycobacterium, הסוכן סיבתי של שחפת (TB), היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם. Drug-רגיש TB היא מחלה שניתן לטפל הדורשת אנטיביוטיקה מרובה לתקופה של 6 חודשים. למרות היותו מחלה שניתן לטפל בה, תמותת TB נאמד ב -1.5 מיליון 2015 ^1. בשנת 10 השנים האחרונות, התרבו חששות השכיחים של שחפת עמידה לתרופות. Multidrug העמיד TB (MDR-TB) מוגדר TB כי הוא עמיד לפחות איזוניאזיד (INH) ו ריפמפיצין (RMP), ורוב זני MDR-TB הם עמידים גם לבחור סמי TB קו שני, ובכך להגביל את אפשרויות טיפול . ההשפעות של עמידות לתרופות ליצור אתגר גדול לטיפול בחולים במשותף נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV); 400,000 חולים ברחבי העולם מתו משחפת HIV הקשורים ב 2015 ^1. למרבה האכזבה, ארצות הברית המזון והתרופות Administיחס אישר תרופה חדשה TB אחד בלבד נגד MDR-TB, bedaquiline, ב ² 40 השנים האחרונות. מקדם במציאת טיפולי TB טובים יותר קצרים יותר יש צורך דחוף כדי להקדים במאבק נגד שחפת MDR-TB.

באופן מסורתי, מסכי סמי TB מבוצעים בתנאי גידול במבחנה במדיום גידול, לפיו תרכובות מתווספות תרבות גוברת והאפקטיביות שלהם בביעור מיקרואורגניזמים נקבעות על ידי ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU) על מדיום מוצק. כמו ספירת CFU הם עבודה אינטנסיבית, גוזל זמן יקר, שיטות עקיפות שונות פותחו כדי להקל על בעיה זו. שיטות אלו כוללות את assay הכדאיות הכחולה Alamar ^3, קביעה של קרינה ⁴ מ חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או הארה ⁵ מחיידקים להביע בלוציפראז, ואת הערכת אדנוזין אדנוזין הכולל (אTP) ^{6, 7.}

TB האופיינית מאופיינת זיהום שחפת של הריאות, שבו החיידקים מתגוררים ולשכפל בתוך phagosomes של מקרופאגים המכתשית ^8. מסך פנוטיפי ב-מרק פשוט עשוי להתאים פתוגנים תאיים; עם זאת, בפרספקטיבה היסטורית, פגע תרכובות נגד שחפת מזוהה בשיטה זו לעיתים קרובות אינם מצליחים לעמוד בציפיות במהלך השלבים אימות במורד הזרם מודלים זיהום. אנו מציעים כי תרופת TB מבוצעת טוב מודל זיהום תא מארח תאי. עם זאת, מודלים תאיים בעלי חסמים טכנולוגיים ביולוגיים רבים לפיתוח הקרנת תפוקה גבוהה (HTS). מכשול גדול הוא המורכבות של תהליך ההדבקה, שהודגם על ידי צעדים רבים וההסרה המשוכללת של חיידקים תאיים על ידי ב-בין הכביסה. משוכה משמעותית שנייה היא מחדש הזמן הממושךquirements, כמו גילוי גידול, בדרך כלל נעשה על ידי CFU לספור על צלחות תרבות, הוא תהליך שלוקח מעל 3 שבועות כדי להשלים. פתרון אחד כדי להחליף ספירת CFU סופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי בשילוב עם חיידקים פלורסנט. עם זאת, פתרון זה דורש השקעה בציוד ראשונית כי הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. פשוט, בעלות נמוכה, ושיטת HTS הרלוונטית-מחלה היו מאוד לשפר את תהליך גילוי תרופות.

במחקר זה, אנו מדווחים מערכת HTS חדשה, מודולרי, המכוונת מתן מהיר, ו מדרגית, עדיין חסכוני, assay מתאים לקביעת הפעילות של תרכובות נגד שחפת תאיים. מערכת זו מורכבת משלושה מודולים: (i) תאי, (ii) רעיל לתאים, וכן (iii) מבחנים-מרק. התוצאה הסופית בשילוב מספקת תיאור מקיף של התכונות המתחמות, עם מידע נוסף לגבי מצב פוטנציאלי פעולה. SC זהreening מערכת נעשה שימוש במספר פרויקטים עם ספריות מתחמות שונות למקד במצב של פעולה, כוללים הניתוח של סינרגיה סמי ^9, הגירוי של autophagy ^10, ואת העיכוב של שחפת -secreted גורם ארסי (לא פורסם). תרכובות של מצב ידוע של פעולה גם נחקרו ^11. גרסה שונה של שיטה זו אומצה גם על ידי שיתוף הפעולה עם התעשייה שלנו כשיטת ההקרנה העיקרית לזהות תרכובות חדשות נגד שחפת תאיים מ ^11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. זן חיידקים וצמיחה בינוני

1. הפוך דקסטרוז אלבומין פתרון מניות מלח (ADS) על ידי solubilizing 25 גרם של אלבומין בסרום שור, 10.0 גרם של דקסטרוז, ו 4.05 גרם של נתרן כלורי ב 460 מ"ל של מים ללא יונים. מסנן לעקר את המודעות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
2. הפוך 7H9 מרק ידי הוספת 4.7 גרם של 7H9 אבקה 2 מ"ל של גליצרול כדי 900 מ"ל של מים מטוהרים. החיטוי מרק 7H9 ב 121 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך. הפוך 7H9ADST ידי הוספת 100 מ"ל של מודעות 0.5 מ"ל של Tween80 כדי 900 מ"ל של 7H9 מרק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. לשקול 50 מ"ג של סולפט kanamycin ו להתמוסס 1 מ"ל של מים ללא יונים; הריכוז הסופי הוא 50 מ"ג / מ"ל. מסנן לעקר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להוסיף 0.5 מ"ל של Kanamycin פתרון מניות לכל 1 ליטר של 7H9ADST.
   הערה: בינוני זה צריך להיעשות טרי, כך לטפס על הכרכים כראוי בהתאם לגודל התרבות.
4. לגדול מ שחפת ב 7H9ADST בתוספת kanamycin בעמידת התרבות. Shake התרבות היומי לדלל אותו לפני OD600 מגיע 1.0 להימנע clumping.
   הערה: זן שחפת המשמש לפיתוח שיטה זו H37Rv טרנספורמציה עם pJAK2.A פלסמיד ^12. pJAK2.A הוא פלסמיד אינטגרטיבי המבוסס על וקטור pMV361, המאפשר ביטוי ברמה גבוהה של הגן בלוציפראז גחלילית מן האמרגן hsp60 וניתן לבחור באמצעות kanamycin.

2. THP-1 בינוני ותחזוקה

1. להוסיף 50 מ"ל של סרום שור העובר חום מומת (FBS) ו 5 מ"ל של 200 מ"מ L- גלוטמין ל 500 מ"ל של RPMI 1640 כדי להפוך RPMI בינוני שלם (כ 10% FBS ו 2 גלוטמין מ"מ).
2. לשמור על תרבית תאים THP-1 על פי פרוטוקול סטנדרטי ^13. בקצרה, לגדל תאים THP-1 במדיום שלם RPMI תוך שמירה על צפיפות התאים שערכה 0.2 1 מיליון דולר מ"ל של מדיום בין pasחכם.

3. תפוקה גבוהה הקרנת תאיים באמצעות H37Rv שחפת להביע בלוציפראז

1. מדוד את הצפיפות האופטית של השעיה חיידקי ומתרחבת ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר. חשב את צפיפות חיידקים באמצעות גורם המרה של 0.1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ חיידקים למ"ל.
2. פיפטה את החיידקים מספיק ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10: 1 לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. גלולה ב 3000 XG במשך 10 דקות לשאוב את הנוזל. להוסיף 50 μL של בסרום אדם 450 μL של RPMI1640. סולם נפח לנכס ערכים לצורך הניסוי.
3. כדי opsonize החיידקים, להשעות את הגלולה בצפיפות של 1 x 10 ⁸ חיידקים לכל 500 μL של RPMI1640 המכילים 10% בסרום אדם. אפשר התערובת כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. קביעת צפיפות תרבית התאים THP-1 על ידי ספירה עם hemocytometer ו microsco הפוכהפ.
4. גלולת התאים ב מבחנות צנטריפוגה סטריליים 100 XG ו 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות התאים RPMI שלם בצפיפות של 1 מיליון תאים למ"ל. להוסיף phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) לריכוז 40 ng / mL הסופי.
   הערה: זה יהיה המכונה תמהיל הבידול.
5. מערבבים שחפת opsonized עם תערובת בידול THP-1 בכל פנים של 10: 1 ו aliquot התמהיל הסופי 100 μL לכל היטב צלחת לבנה 96-היטב שטוחה תחתונה. באופן קבוע ומערבבים את התערובת על מנת להבטיח אחידות. אפשר בידול וזיהומים להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO _2.
6. לשטוף את הבארות פעמיים עם 100 μL של RPMI כל. הוספת תרכובות בדילול אל הריכוז הרצוי RPMI שלם דגירה במשך 3 ימים.
7. לשאוב את המדיום מהבארות. להוסיף 50 μL של מגיב בדיקה לוציפראז היטב כל אחד. חותם את הצלחות עם tאיטום צלחת דבק ransparent. אפשר 5 דקות של דגירה על 22 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לקבל הודעה בתוך luminometer ב 1 s לכל היטב.

4. ניתוח Cytotoxicity שימוש 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) Assay ¹⁴

1. למדו להבחין בתאי THP-1 ב RPMI בתוספת שלמה עם 40 ng / mL של PMA צלחות 96-היטב ברורות. לשמור על צפיפות התאים של 1 מיליון דולר מ"ל ו aliquot 100 μL לכל טוב. אפשר בידול כדי להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO _2.
2. לשאוב את המדיום מבאר ולשטוף אותם פעמים עם RPMI 1640. הוספת תרכובות מדוללות RPMI שלמים אל הבארות. דגירה של 3 ימים.
3. ממיסים 0.5 גרם של MTT ב 100 מ"ל של בופר פוספט (PBS) כדי להפוך את פתרון המניות של 5 מ"ג / מ"ל. מסנן וחנות סטריליים -20 ° C, הרחק מאור; עדיף לעשות את הפתרון הזה טרי.
4. 2.5 h beforדואר תום תקופת הדגירה 3 ימים, להוסיף 25 μL של פתרון MTT היטב כל ולהשלים את תקופת הדגירה.
5. הכן 50% N, לפוראמיד -dimethyl N (DMF) על ידי ערבוב 250 מ"ל של DMF עם 250 מ"ל מים ללא יונים.
6. הכן חיץ החילוץ MTT כדלקמן: לשקול 100 גרם של SDS בבקבוק 500 מ"ל ולהוסיף 300 מ"ל של 50% DMF. החל חום נמוך כדי לאפשר SDS להתמוסס. להוסיף 10 מ"ל של חומצה אצטית טהורה 12.5 מ"ל של 1 M HCl. מלאו עד לציון 500 מ"ל עם 50% DMF; ההרכב הסופי של חיץ החילוץ הוא 50% DMF, 20% SDS, 2.5% חומצה אצטית, ו 2.5% 1 חומצה הידרוכלורית M.
7. בתום תקופת הטיפול, להוסיף 100 μL של חיץ חילוץ (מחומם 45 מעלות צלזיוס כדי לפזר כל גבישים) זה טוב. אפשר תערובת כדי לדגור לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO _2. קראו את הספיגה ב 570 ננומטר.
   הערה: assay cytotoxicity מבוצע טוב במקביל עם intracellמסך ular שימוש באותן-אצווה וגיל של תאים THP-1.

5.-מרק ניתוח פעילות באמצעות ³ Assay Resazurin

1. לגדול מ שחפת ב 7H9ADST לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - .8 OD _600). לדלל את התרבות עם 7H9ADST כדי 0.01 OD _600. לדלל את התרכובות ב 7H9ADST פי 2 ריכוזי בדיקות aliquot 100 μL של כל תרכובת מדוללת לתוך זה גם.
2. העבר 100 μL של השעית החיידקים מדולל לתוך זה גם. אפשר הצלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עבור 5 ימים. ממיסים 10 מ"ג של resazurin ב 100 מ"ל של מים ללא יונים ולסנן סטרילית.
3. להוסיף 30 μL של פתרון resazurin ולנטר את שינוי הצבע אחרי 48 h; התפתחות חיידקים מצוינת על ידי מרת צבע מכחול לורוד.
   הערה: ניתוח כמותי יכול להתבצע גם על ידי מדידת גם את הקרינה בבית 590 ננומטר עם עירור ב 530 - 560ננומטר או את הספיגה ב 570 ננומטר ו 600 ¹⁵ ננומטר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תפוקה גבוהה הקרנה תאית באמצעות שחפת לבטא את הגן בלוציפראז

איור 2A ולוח 1 מכילים את הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי luminometer, המבוטא ביחידות זורחות יחסית (RLU), מראים את ההשפעה של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת HTS פשוטה וחסכונית באמצעות מודל זיהום תאיים אדם עבור שחפת. שחפת היא מחלה אנושית מתאפיינת הזיהום של מקרופאגים המכתשית ידי מ שחפת. בשל בעיות בטיחות ביולוגיות, המחקר מעורב מודלים ביולוגיים של שני החיידק ואת תאי המארח נעשה שימו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717