세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

요약

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

초록

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

서문

결핵균, 결핵 (TB)의 원인이되는 에이전트는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인이다. 약물에 민감한 TB 6 개월의 기간 동안 여러 항생제를 필요로하는 치료가 가능한 질환입니다. 치료 가능한 질병 임에도 불구하고, 결핵 사망률은 2015 ^일에서 150 만 것으로 추정되었다. 지난 10 년 동안, 약제 내성 결핵균의 유병률에 대한 우려가 증가하고있다. 다제 내성 결핵 (MDR-TB)가 적어도 이소니아지드 (INH) 리팜피신 (RMP), 가장 MDR-TB 균주 따라서 치료 옵션을 제한 두번째 선 TB 약물을 선택하는 것이 내성에 강한 TB로 정의된다 . 약제 내성의 효과는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 환자의 공동 치료를위한 큰 도전을 생성; 40 환자는 전 세계적으로 2,015 ¹ HIV 관련 결핵으로 사망. 실망, 미국 식품의 약국 Administ배급은 지난 40 년 ^2, MDR-TB, bedaquiline에 대한 하나의 새로운 결핵 약을 승인했다. 더 짧은 TB 치료를 찾는의 발전이 시급히 TB와 MDR-TB의 싸움에 앞서 유지하기 위해 필요하다.

전통적으로, TB 약물 스크린 화합물은 성장 배양에 첨가하여 미생물의 박멸에 그 효과는 고체 배지에서 집락 형성 단위 (CFU)을 계산하여 결정함으로써 성장 배지에서 체외 성장 조건 하에서 수행된다. CFU 카운트는 노동 집약적, 시간 소모, 비용이 많이 드는만큼, 다양한 간접 방법이 문제를 완화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법들은하는, Alamar 블루 생존 분석 ^3, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼 라제를 발현하는 박테리아에서 형광 발광 ^{5 (4)의} 결정 및 총 아데노신 삼인산의 추정 (A 포함TP) ^6,7.

전형적인 TB는 박테리아 상주 폐포 대 식세포 ^(8)의 내부 phagosomes 복제 폐,의 결핵균 감염에 의해 특징된다. 간단한에서 국물 표현형 화면이 세포 외 병원균에 맞게 할 수있다; 그러나, 역사적 관점에서이 방법을 사용하여 식별 결핵균에 대한 화합물은 종종 감염 모델에서 다운 스트림 검증 단계에서 기대에 부응하는 데 실패했다. 우리는 결핵 약물이 가장 세포 내 숙주 세포 감염 모델에서 수행되는 것을 제안한다. 그럼에도 불구하고, 세포 내 모델은 높은 처리량 스크리닝 (HTS) 개발에 많은 기술적, 생물학적 장벽을 가지고있다. 큰 장애물은 여러 단계와 세정 사이에 의하여 세포 외 박테리아의 정교한 제거 예로, 악성 프로세스의 복잡성이다. 두 번째 주요 장애물은 긴 시간 재quirements는 일반적으로 CFU 문화 판에 계산에 의해 수행 성장 탐지으로 완료하는 데 3 주 이상 걸리는 과정이다. CFU 카운트를 대체하는 하나 개의 솔루션은 형광 박테리아와 함께 자동 형광 현미경으로 제공되었습니다. 그러나,이 솔루션은 많은 연구 실험실의 손이 닿지이다 초기 설비 투자를 필요로한다. 간단하고 저렴한 비용, 질병 관련 HTS 방법은 크게 신약 개발 프로세스를 향상시킬 것입니다.

본 연구에서는 세포 내 결핵균에 대한 화합물의 활성을 결정하기에 적합한 빠른, 높은 확장 성이면서 경제적 인 분석을 제공하는 것을 목적으로, 새로운 모듈 형 HTS 시스템에보고한다. (나) 세포, (ⅱ) 세포 독성, 및 (iii)의 국물 분석법 :이 시스템은 세 개의 모듈로 구성된다. 합한 최종 결과는 액션의 전위 모드와 같은 추가 정보, 화합물 성질의 포괄적 인 설명을 제공한다. 이 SC시스템 reening하는 것은 약물 시너지 ^(9)의 분석을 포함한 행동 모드를 대상으로 다양한 화합물 라이브러리, 여러 프로젝트에서 사용되고, 자식 작용 ^(10)의 자극, 및 결핵균의 억제 독성 인자 (미공개) -secreted. 행동의 알 수없는 모드의 화합물은 또한 ¹¹ 연구되고있다. 이 방법의 수정 된 버전은 또한 세포 내 결핵균 ^(11)에 대해 새로운 화합물을 식별 차 스크리닝 방법으로서의 산업 파트너가 채택되었다.

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프로토콜

1. 균주 및 성장 매체

1. 소 혈청 알부민 25 g, 덱 스트로스 10.0 g, 및 탈 이온수 460 ㎖의 염화나트륨 4.05 g을 가용화하여 알부민 스트로스 염화칼슘 원액 (ADS)을 만든다. 4 ° C에서 ADS 및 저장을 필터 소독.
2. 7H9 분말 4.7 g 및 정제수 900 mL의 글리세롤 2 mL를 첨가하여 7H9 국물을 만들기. 10 분 동안 121 ° C에서 7H9 액체 배지를 오토 클레이브가 진행하기 전에 실온으로 냉각시킨다. ADS 100㎖로 7H9 액체 배지 900 ㎖의 트윈 80을 0.5 mL를 첨가하여 7H9ADST합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
3. 카나마이신 설페이트 50 mg의 무게를 측정하고 1 ㎖ 탈 이온수에 녹여; 최종 농도 50 ㎎ / ㎖이다. 필터 소독 및 -20 ° C에서 보관. 7H9ADST의 1 L 당 원액을 카나마이신 0.5 ML을 추가합니다.
   이 매체는 신선한해야한다, 그래서 문화의 크기에 따라 적절하게 볼륨을 확장 : 참고.
4. 7H에서 결핵균 성장9ADST 문화 서에서 카나마이신으로 보충. 매일 문화를 흔들어하고 OD600이 응집을 방지하기 위해 1.0에 도달하기 전에 희석.
   주 :이 방법의 개발에 사용되는 결핵균 H37Rv 균주 pJAK2.A ¹² 플라스미드로 형질 전환 하였다. pJAK2.A은 Hsp60에 프로모터 반딧불이 루시퍼 라제 유전자의 높은 수준의 발현을 허용하고 카나마이신을 사용하여 선택 될 수 pMV361 벡터에 기초하여 통합 플라스미드이다.

2. THP-1 중간 및 유지 보수

1. RPMI를 완전 배지 (대략 10 % FBS와 2 mM의 글루타민)을 만들기 위해 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS) 및 RPMI 1640 500 ㎖ 내지 200 mM의 L- 글루타민 5 ㎖ 50 ㎖의 추가.
2. 표준 프로토콜에 따라 ¹³ THP-1 세포 배양 물을 유지한다. PAS 사이 배지 1 ㎖ 당 0.2 내지 1 백만의 셀 밀도를 유지하면서 간단하게, 완전 RPMI 배지에서 THP-1 세포를 성장현인.

3. 높은 처리량 세포 내 검사 루시 페라 제 발현 M. 결핵 H37Rv 사용

1. 600 nm의 파장에서 분광 광도계에서 활발히 성장 세균 현탁액의 광학 밀도를 측정한다. mL를 0.1 OD ₆₀₀ = 3 × ¹⁰⁷ 세균의 변환 계수를 이용하여 박테리아의 밀도를 계산한다.
2. 새로운 원심 분리 튜브로 1 : 10의 감염 (MOI)의 다수 충분한 박테리아를 피펫. 10 분 동안 3,000 XG에서 펠릿 액체를 흡인. RPMI1640의 450 μL에 인간 혈청 50 μL를 추가합니다. 실험에 대한 값을 적절한하기 위해 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
3. 박테리아 opsonize 위해 10 % 인간 혈청을 함유하는 RPMI1640 500 μL 당 1 × ¹⁰⁸ 세균의 농도로 펠렛을 재현 탁. 혼합물을 30 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수있다. 혈구와 반전 microsco 카운팅하여 THP-1 세포 배양 물 농도를 결정체육.
4. 100 XG에서 멸균 원심 분리 튜브에 세포 펠렛을 10 분간 37 ° C. 상등액을 흡인하고 불완전 mL의 1 개 백만 세포의 밀도로 RPMI에서 세포를 재현 탁. 40 NG / ㎖ 최종 농도 포볼 -12- 미리 스테이트 -13- 아세테이트 (PMA)를 추가한다.
   참고 :이이 분화 믹스라고한다.
5. 10의 MOI에서 THP-1 분화 믹스 옵 소닌 결핵균 결합 : 1, 96- 웰 평면 바닥 플레이트에서 흰색 웰 당 100 μL의 최종 믹싱 나누어지는. 정기적 균일 성을 보장하기 위해, 혼합물을 교반한다. 분화 및 감염 5 % _CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 진행하도록 허용.
6. RPMI 각 100 μL로 두 번 우물을 씻으십시오. 완전 RPMI에서 원하는 농도로 희석 된 화합물을 첨가하고 3 일 동안 배양한다.
7. 웰로부터의 배지를 흡인. 각 웰 루시퍼 라제 분석 시약 50 μL를 추가한다. t와 플레이트를 밀봉ransparent 접착제 플레이트 씰러. 22 ° C에서 배양 5 분을 허용 한 후 1 초에 루미의 판독을 얻기 웰당.

4. 세포 독성 분석 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하여 검정 ⁽¹⁴⁾

1. RPMI에서 THP-1 세포 분화 불완전 맑은 96 웰 플레이트에서 40 NG PMA / ㎖로 보충. 셀 mL의 1 백만의 밀도와 나누어지는 잘 당 100 μL를 유지한다. 분화가 5 % _CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 진행하도록 허용.
2. 웰에 완전 RPMI에 희석 된 화합물을 추가 웰로부터 배지를 흡인하고 RPMI 1640 회 씻는다. 3 일 품어.
3. 5 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을하기 위해 인산 완충 용액 (PBS)을 100 mL의 MTT 0.5 g을 녹이고. 광 거리에서 -20 ° C에서 살균 필터 및 저장; 그것은이 솔루션 신선하게하는 것이 가장 좋습니다.
4. 2.5 시간을 befor전자 3 일간의 잠복기의 끝, 각 웰에 MTT 용액 25 μL를 추가하고 잠복기를 완료합니다.
5. 50 % N을 준비 N의 디메틸 포름 아미드 (DMF), 탈 이온수 250ml를 DMF 250ml의 혼합함으로써.
6. 다음 MTT 추출 버퍼 준비 : 500 ㎖의 병 SDS 100g의 무게를 재고 50 % DMF 300 mL를 첨가. SDS 용해 할 수 있도록 낮은 열을 적용합니다. 순수한 아세트산 10 mL의 1 M 염산 12.5 mL를 넣고. 50 % DMF와 500mL의 마크까지 채우고; 추출 완충액의 최종 조성물은 50 %의 DMF, 20 % SDS, 2.5 % 아세트산, 2.5 %, 1 개 M 염산이다.
7. 처리 기간의 마지막에, 각 웰에 (모든 결정을 용해 45 ℃로 가온) 추출 완충액 100 μL를 추가한다. 혼합물을 37 ℃에서 밤새 배양 허용 5 % _CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 C를 °. 570 nm에서 흡광도를 읽어보십시오.
   주 : 세포 독성 분석을 가장 잘 인트라 셀에 병렬로 수행THP-1 세포의 동일 배치 나이를 사용하여 울라 화면.

5.에서-국물 활동 분석은 레사 주린 분석 ^(3)를 사용하여

1. 미드 로그 상 (- OD ₆₀₀ 0.8 ~ 0.5)로 7H9ADST에서 결핵균 성장. 0.01 OD _600에 7H9ADST로 배양을 희석. 각 웰에 희석 된 화합물을 각각의 시험 농도 및 100 μL 분취를 2 배 7H9ADST의 화합물을 희석한다.
2. 각 웰에 희석 된 세균 현탁액 100 ㎕를 옮긴다. 플레이트를 5 일 동안 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양 할 수있다. 탈 이온수 및 살균 필터 100 mL에 레사 주린 10 ㎎을 용해.
3. 30 μL 레사 주린 용액에 추가하고 48 시간 후 색상 변화를 모니터링; 세균의 성장은 분홍색 파란색에서 색 변환으로 표시됩니다.
   주 : 정량 분석도 530에서 여기와 590 nm에서의 형광 중 하나를 측정함으로써 수행 될 수있다 - 560나노 미터 또는 570 nm에서의 흡광도와 600 nm의 ^15.

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결과

루시퍼 라제 유전자를 발현 결핵균을 이용하여 높은 처리량 스크리닝 세포

도 2a 및 표 1은 루미 의해 수집 된 원시 데이터, THP-1 세포 안에 결핵균의 TB 약물 리팜피신의 농도 증가의 효과를 나타내는, 상대적 형광 단위 (RLU)에서 발현 함유한다. 도 2a는 리팜피신의 다양한 농도?...

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토론

이 연구의 목적은 결핵균에 대한 인간의 세포 내 감염 모델을 사용하여 간단하고 비용 효율적인 HTS 방법을 만드는 것이 었습니다. 결핵은 M. 결핵하여 폐포 대 식세포의 감염에 의해 특징 인간의 질병이다. 때문에 바이오 안전성 문제, 박테리아 및 숙주 세포 모두의 생물학적 모델을 포함하는 연구는 과거에 사용되어왔다. 그러나,이 대리 박테리아와 인간이 아닌 모델의 사용은 약물 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717