Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Резюме

Мы разработали модульную систему скрининга с высокой пропускной способностью для обнаружения новых соединений в отношении микобактерий туберкулеза, нацеливание внутриклеточных и в-бульоне растущих бактерий, а также цитотоксичность против клетки - хозяина млекопитающего.

Аннотация

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Введение

Микобактерии туберкулеза, возбудитель туберкулеза (ТБ), является ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Drug-чувствительный туберкулез поддается лечение заболевания, которое требует несколько антибиотиков на срок от 6 месяцев. Несмотря на то , поддающееся лечению заболевание, смертность от туберкулеза, по оценкам, 1,5 миллиона в 2015 году ^1. За последние 10 лет, увеличивались озабоченность по поводу распространенности лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. С множественной лекарственной устойчивостью туберкулеза (МЛУ-ТБ) определяется как туберкулез, который устойчив к по меньшей мере, к изониазиду (изониазид) и рифампицин (РМП), а большинство штаммов МЛУ-ТБ также устойчивы, чтобы выбрать препараты второго ряда ТБ, ограничивая тем самым возможности лечения , Последствия лекарственной устойчивости создают большую проблему для лечения пациентов с сочетанной инфекцией вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ); 400000 пациентов по всему миру умерли от ВИЧ-ассоциированного туберкулеза в 2015 году ^1. Disappointingly, пищевых продуктов и медикаментов США AdministРацион одобрил только один новый препарат против туберкулеза с МЛУ-ТБ, bedaquiline, в течение последних 40 лет ^2. Прогресс в поиске более и более короткие терапии ТБ крайне необходимы для того, чтобы оставаться впереди в борьбе с ТБ и МЛУ-ТБ.

Традиционно, экраны наркотиков ТБ проводят в условиях , в пробирке роста в среде для роста, в результате чего соединения добавляют к растущей культуре , и их эффективность в уничтожении микроорганизмов , которые определяются путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на твердой среде. Как КОИ отсчеты трудоемкие, занимает много времени, и дорого, различные косвенные методы были разработаны для решения этой проблемы. Такие способы включают в себя жизнеспособность анализа Alamar Blue ^3, определение флуоресценции ⁴ из зеленого флуоресцентного белка (GFP) или люминесценции ⁵ из люциферазы-экспрессирующих бактерий, а также оценку общего аденозинтрифосфата (AТП) ^{6, 7.}

Типичный ТБ характеризуются туберкулезной инфекцией M. легкого, где бактерии проживают и реплицировать внутри фагосом альвеолярных макрофагов ^8. Простой экран фенотипического в бульоне может удовлетворить внеклеточные патогены; Однако, в исторической перспективе, ударил соединение против микобактерий туберкулеза , идентифицированное с помощью этого метода часто не оправдали ожидания во время последующих этапов проверки в моделях инфекции. Мы полагаем, что препарат ТБ лучше всего проводить в внутриклеточной модели инфекции клетки-хозяина. Тем не менее, внутриклеточные модели обладают многими технологическими и биологическими барьерами для скрининга (HTS) развития с высокими пропускной способностью. Большое препятствие является сложность инфекционного процесса, на примере многочисленных этапов и сложного удаления внеклеточных бактерий в промежутке между стиркой. Второе основное препятствие является длительным время повторноquirements, как обнаружение роста, обычно проводимой КОЕ в расчете на культуральных планшетах, это процесс, который занимает более 3 недель, чтобы закончить. Одно решение для замены счетчиков КОИХ было обеспечено автоматизированной флуоресцентной микроскопией в сочетании с люминесцентными бактериями. Однако это решение требует первоначальных инвестиций оборудования, которое вне досягаемости для многих научно-исследовательских лабораторий. Простой, недорогой и болезни соответствующего метода HTS бы значительно улучшить процесс обнаружения наркотиков.

В этом исследовании мы сообщаем о новой, модульной системе HTS, которая направлена на обеспечение быстрого и высоко масштабируемый, экономичный, анализа , пригодный для определения активности соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза. Эта система состоит из трех модулей: (я) внутриклеточных, (II) цитотоксичность, и (III) в бульоне-анализах. В сочетании конечный результат обеспечивает полное описание составных свойств, с дополнительной информацией как с потенциальным механизмом действия. Это СБНreening системы были использовано в нескольких проектах с различными библиотеками соединений , которые способом действия цели, включая анализ наркотики синергии ^9, стимуляция аутофагии ^10, а также ингибирование микобактерий туберкулеза -secreted фактор вирулентности (неопубликованный). Соединения неизвестного способа действия также были изучены ^11. Модифицированная версия этого метода была также принята нашим промышленным партнером в качестве основного метода скрининга для выявления новых соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза ^11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Бактериальный штамм и рост среднего

1. Сделать декстрозу альбумина и соли исходного раствора (ADS) путем солюбилизации 25 г бычьего сывороточного альбумина, 10,0 г декстрозы и 4,05 г хлорида натрия в 460 мл деионизированной воды. Фильтр-стерилизовать ADS и хранят при температуре 4 ° С.
2. Сделать 7H9 бульон добавлением 4,7 г 7H9 порошка и 2 мл глицерина в 900 мл очищенной воды. Автоклав 7H9 бульона при 121 ° С в течение 10 мин и дать ему остыть до комнатной температуры, прежде чем продолжить. Сделать 7H9ADST добавлением 100 мл ADS и 0,5 мл Tween80 в 900 мл бульона 7H9. Хранить при 4 ° С.
3. Взвешивают 50 мг сульфата канамицина и растворяют в 1 мл деионизованной воды; конечная концентрация составляет 50 мг / мл. Фильтр-стерилизовать и хранить при -20 ° С. Добавьте 0,5 мл канамицина исходного раствора на 1 л 7H9ADST.
   Примечание: Эта среда должна быть свежей, так масштабировать объемы надлежащим образом в соответствии с размером культуры.
4. Grow микобактерии в 7H9ADST с добавлением канамицина в отстаивании культуры. Встряхнуть культуру ежедневно и разбавить его до того, как OD600 достигает 1,0, чтобы избежать образования комков.
   Примечание: Этот штамм туберкулеза М. используется для разработки этого метода был H37Rv , трансформированные плазмидой pJAK2.A ^12. pJAK2.A является интегративной плазмиду на основе вектора pMV361, что позволяет экспрессию на высоком уровне светлячка гена люциферазы из промотора hsp60 и может быть выбран с помощью канамицина.

2. THP-1 Средний и обслуживание

1. Добавить 50 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 ​​мл 200 мМ L-глутамина до 500 мл среды RPMI 1640, чтобы сделать среду RPMI неполной (приблизительно 10% FBS и 2 мМ глутамина).
2. Поддержание культуры клеток ТНР-1 согласно стандартному протоколу ^13. Если коротко, то растут ТНР-1 клеток в RPMI неполной среды, сохраняя при этом плотность клеток 0,2 до 1 млн на мл среды между памудрецы.

3. Высокая пропускная способность внутриклеточного скрининга с использованием люциферазы-экспрессирующих М. туберкулеза H37Rv

1. Измерьте оптическую плотность активно растущей бактериальной суспензии на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Вычислить плотность бактериальной , используя коэффициент пересчета 0,1 OD ₆₀₀ = 3 × 10 ⁷ бактерий на мл.
2. Пипетировать из бактерий достаточные для множественности инфекции (MOI) 10: 1 в новую пробирку центрифуги. Гранулы при 3000 мкг в течение 10 мин и отсасывает жидкость. Добавляют 50 мкл сыворотки крови человека до 450 мкл RPMI1640. Шкала громкости в соответствующие значения для эксперимента.
3. Для того, чтобы opsonize бактерии, ресуспендируют осадок при плотности 1 × 10 ⁸ бактерий на 500 мкл RPMI 1640 , содержащей 10% сыворотки человека. Разрешить смесь инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Определить плотность клеток культуры ТНР-1 путем подсчета с помощью гемоцитометра и перевернутой microscoфизическое воспитание
4. Гранулы клетки в стерильных центрифужных пробирках при 100 мкг и 37 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в среде RPMI неполным при плотности 1 миллиона клеток на мл. Добавить форболовый-12-миристат-13-ацетата (PMA) в / мл конечной концентрации 40 нг.
   Примечание: Это будет называться дифференциации смеси.
5. Зерноуборочный опсонизированным M. туберкулез с ТНР-1 дифференциации смеси при MOI 10: 1 и аликвоту окончательную смесь в количестве 100 мкл на лунку в 96-луночных плоскодонных белой тарелке. Регулярно смесь перемешивают, чтобы обеспечить однородность. Дайте дифференцировка и инфекции , чтобы продолжить в течение ночи при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO _2.
6. Промыть лунки дважды 100 мкл RPMI каждого. Добавьте соединения разводили до желаемой концентрации в RPMI неполной и инкубировать в течение 3-х дней.
7. Аспирируйте среду из лунок. Добавьте 50 мкл реагента люциферазы анализа в каждую лунку. Уплотнение пластин с тransparent клеевые шпатлевки пластины. Разрешить 5 мин инкубации при 22 ° С, а затем получить отсчет в люминометре на 1 с на лунку.

4. Анализ цитотоксичности , используя 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразоли (МТТ) ¹⁴

1. Дифференцирование клетки ТНР-1 в среде RPMI с добавлением неполного 40 нг / мл РМА в прозрачных 96-луночных планшетах. Поддержание плотности клеток 1 млн на мл и аликвоты 100 мкл на лунку. Разрешить дифференцировка продолжать в течение ночи при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO _2.
2. Аспирируйте среду из лунок и промыть их дважды RPMI 1640. Добавьте соединения разводили в среде RPMI неполных в лунки. Выдержите в течение 3-х дней.
3. Растворить 0,5 г МТТ в 100 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), чтобы сделать исходный раствор 5 мг / мл. Стерильный фильтр и хранят при -20 ° С, в защищенном от света; то лучше сделать это решение свежим.
4. 2,5 ч Beforе конец инкубационного периода 3-х дней, добавляют по 25 мкл раствора МТТ в каждую лунку и завершить инкубационный период.
5. Готовят 50% N, N - диметилформамид (ДМФ) путем смешивания 250 мл ДМФ с 250 мл деионизированной воды.
6. Подготовка буфера для экстракции МТТ следующим образом: Взвешивают 100 г SDS в бутылке 500 мл и добавляют 300 мл 50% ДМФ. Нанести низкотермичное, чтобы позволить SDS растворяться. Добавляют 10 мл чистой уксусной кислоты и 12,5 мл 1 М HCl. Заполните до отметки 500 мл с 50% ДМФ; окончательный состав буфера для экстракции составляет 50% ДМФ, 20% SDS, 2,5% уксусной кислоты и 2,5% 1 М соляной кислоты.
7. В конце периода лечения, добавляют 100 мкл буфера для экстракции (подогретой до 45 ° С, чтобы растворить любые кристаллы) в каждую лунку. Разрешить смесь инкубируют в течение ночи при 37 ° C в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO _2. Измерить оптическую плотность при 570 нм.
   Примечание: Анализ цитотоксичности лучше всего проводить параллельно с внутриклеточнойЭкран улар используя ту же партию-и возраст клеток ТНР-1.

5. В-бульоне активность анализ с помощью резазурин Assay ³

1. Grow микобактерии в 7H9ADST к середины логарифмической фазы (~ 0,5 - 0,8 OD _600). Развести культуру с 7H9ADST до 0,01 OD _600. Развести соединений в 7H9ADST в 2 раза концентрации испытаний и аликвоты по 100 мкл каждого разведенного соединения в каждую лунку.
2. Передача 100 мкл разбавленного бактериальной суспензии в каждую лунку. Разрешить планшеты инкубировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе в течение 5 дней. Растворяют 10 мг резазурин в 100 мл деионизированной воды и стерильный фильтр.
3. Добавить 30 мкл раствора резазурин и следить за изменением цвета после 48 часов; бактериальный рост обозначается преобразование цвета от синего до розового.
   Примечание: Количественный анализ также может быть выполнена путем измерения либо флуоресценции при длине волны 590 нм с возбуждением при 530 - 560нм или поглощение при 570 нм и 600 нм ^15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Высокая пропускная способность внутриклеточного скрининга с использованием микобактерии , выражающую ген люциферазы

Рисунок 2A и Таблица 1 содержит необработанные данные , собранные люминометра, выражены в отно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Цель данного исследования состояла в том, чтобы создать простой и экономически эффективный метод HTS с использованием человеческой внутриклеточной модели инфекции для микобактерий туберкулеза. Туберкулез является человек заболевание , характеризующееся инфекции альвеолярных м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717