حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا<em&gt; في المختبر</em&gt; من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم T7

Summary

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Abstract

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Introduction

تكرار الحمض النووي هو ميزة الحفظ لجميع أشكال الحياة الخلوية. في حين هوية وعدد من مكونات النسخ المتماثل تختلف على نطاق واسع، ويشارك في الآليات العامة عبر تطور ^1. هنا، نحن تصف والتجارب الحركية متقطعة القائم على هلام، وذلك باستخدام ركائز المشعة، التي تهدف إلى فهم حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر عن طريق مكونات جسيم مكرر T7. آلية تكرار T7 عاثية بسيطة جدا، تتكون من البروتينات أربعة فقط (بوليميريز الحمض النووي، GP5، وعامل processivity لها، كولاي thioredoxin، وGP4-بريميز هيليكاز bifunctional، وبروتين DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ملزم، GP2. 5) ^2. هذه الميزة تجعل من نظام نموذجا جذابا لدراسة الآليات البيوكيميائية الحفظ تشارك في تكرار الحمض النووي.

ويتم التركيز بشكل خاص على تشكيل الاشعال ريبونوكليوتيد التي كتبها T7 الحمض النووي بريميز، وهو حرجةخطوة لتر في الشروع في تركيب الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن ينظر أيضا في استخدام هذه البادئات من قبل البلمرة T7 الحمض النووي أو البروتينات النسخ الأخرى عن طريق إشراكها في خليط التفاعل. وT7 بريميز-هيليكاز، GP4، يحفز تشكيل الاشعال لتخليق الحمض النووي في تسلسل الحمض النووي محددة تسمى المواقع الاعتراف بريميز، أو استراتيجية الحد من الفقر، (5'-GTC-3 '). والسيتوزين في استراتيجية الحد من الفقر هو خفي، فمن الضروري للاعتراف الموقع، ولكن لا يتم نسخ ذلك في المنتج ^3. الخطوة الأولى في التوليف التمهيدي من GP4 تتضمن تشكيل ثنائي النوكليوتيد pppAC، التي امتدت بعد ذلك لأرتب، وفي نهاية المطاف إلى الاشعال رباعي النوكليوتيد الوظيفية pppACCC، pppACCA، أو pppACAC تبعا لتسلسل في قالب ^4. ويمكن بعد هذه الاشعال يتم استخدامها من قبل البلمرة T7 الحمض النووي للشروع في تركيب الحمض النووي، والذي هو أيضا عملية بمساعدة GP4 ^{5، 6.} في هذا الصدد، وبريميزنطاق استقرار tetraribonucleotides قصيرة للغاية مع القالب، ومنع التفكك، ويشارك البلمرة DNA بطريقة تؤدي إلى تأمين التمهيدي / القالب إلى موقع نشط ⁷ البلمرة. وتتكرر هذه الخطوات (RNA التوليف التمهيدي، عمليتي التحول التمهيدي لالبلمرة، والإرشاد) في دورات متعددة لتكرار حبلا متخلفة ويجب أن ينسق مع تكرار حبلا الرائدة.

المقايسات الموصوفة هنا هي حساسة للغاية، ويمكن أداؤها في إطار زمني المعتدل. ومع ذلك، فهي نسبيا منخفضة الإنتاجية وعناية كبيرة يجب أن تمارس في الاستخدام والتخلص من المواد المشعة. اعتمادا على السرعة التي حصيلة التفاعل، يمكن للمرء أن يستخدم أداة لإخماد السريع لتحقيق العينات في فترات زمنية قابلة للتحليل مغزى من الدورات وقت رد الفعل إما في ثابت أو دولة ما قبل مستقرة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا المقايسات وصفها هنا لتقديم evidenc(ه) من أهمية إطلاق التمهيدي من المجال بريميز من GP4 في بدء شظايا أوكازاكي. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا دليلا على وجود دور تنظيمي لالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل T7 البروتين، gp2.5 ملزمة، في تعزيز تشكيل التمهيدي كفاءة واستخدام ^8.

Protocol

ملاحظة: اتبع جميع الأنظمة المؤسسية بشأن الاستخدام الآمن والتخلص من المواد المشعة، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر، واستخدام معدات الوقاية الشخصية، مثل القفازات، ونظارات السلامة، معطف المختبر، والدروع الاكريليك المناسبة.

ملاحظة: يتكون عازلة معيار من 40 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي الغلوتامات البوتاسيوم، 5 ملي DTT و 0.1 ملي EDTA (ومسبقة الصنع هذا المخزن المؤقت عند تركيز 5X) و 0.3 ملم من كل dNTP. ويتم تنقية البروتينات تكرار T7 كما هو موضح ^{8 و 9 و 10.} الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد يحتوي على واحد T7 الموقع الاعتراف بريميز (5'-GGGTC-3 "، 5'-GTGTC-3"، 5'-TGGTC-3 ') يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من الشركات توليف الحمض النووي (طول وssDNA قد تعتمد على انزيم الاختيار، لبريميز T7، وهو مخموس هو الحد الأدنى لطول قالب لتجميع التمهيدي كامل طول ¹1، كما خفي C ضروري، ولكن إذا التمهيدي هو للتمديد من قبل البلمرة، يجب أن يكون النيوكليوتيدات إضافية موجودة في نهاية 3 'من القالب. وبدأت ردود الفعل من خلال إضافة تركيز النهائي من 10 ملي MgCl ₂ وحضنت عند 25 درجة مئوية. أخذ العينات اليدوية تعمل بشكل جيد لفترة نقاط من 5 ثوان أو أكثر. إذا كانت هناك حاجة للوقت نقطة أقصر من ذلك، فمن المستحسن استخدام أداة تدفق إخماد السريع للحصول على بيانات دقيقة.

1. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل من جانب أخذ العينات اليدوية

1. قبل بدء التجربة، قسامة 2 ميكرولتر من العازلة صبغ الفورماميد (93٪ (ت / ت) الفورماميد، 50 ملي EDTA، 0.01٪ سيانول زايلين و 0.01٪ برموفينول الأزرق) إلى 8 1.5 أنابيب البولي بروبلين مل. بشكل عام، وعدد من الأنابيب هو مساو لعدد من الزمن نقاط تحليلها.
2. تحضير خليط 20 ميكرولتر تتكون 1X العازلة، 0.1 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP، 0.25 زارة التجارة والصناعة / مل [α- ³² ف] CTP، 0.1 ميكرومتر SSDقالب NA، و 0.1 ميكرومتر GP4 (معبرا عنها تركيز مسدوس - 0.6 ميكرومتر مونومر).
3. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
4. إزالة 2 ميكرولتر من الخليط باستخدام pipettor وتخلط مع 2 ميكرولتر عازلة صبغ الفورماميد في أنبوب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1 لأي ​​السيطرة على رد فعل (الساعة صفر).
5. إضافة 2 ميكرولتر من 0.1 M MgCl ₂ إلى خليط التفاعل (لتركيز النهائي من 10 ملم).
6. سحب يدويا 2 عينات ميكرولتر من خليط التفاعل باستخدام pipettor في الصورة فترات 10 وتخلط مع صبغ الفورماميد predispensed في أنابيب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1.
7. عينات الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة الحرارة.
8. تحميل aliquots من العينات على هلام تغيير طبيعة. يتم حل المنتجات التمهيدي tetraribonucleotide صغيرة توليفها من قبل بريميز T7 جيدا على 0.4 مم 25٪ الأكريلاميد: bisacrylamide (19: 1)، 3 M اليوريا، 1X TBE (100 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA).
9. وضع الجل بالكامل على chromatograورقة فيز والغطاء مع غلاف بلاستيكي. هلام الجافة باستخدام أكثر جفافا هلام.
10. إعداد سلسلة تخفيف ما تبقى من خليط التفاعل وبقعة نفس حجم تحميلها على هلام على ورقة اللوني، أي بقعة 4 ميكرولتر من التخفيف إذا تم تحميل 4 ميكرولتر من العينة.
    ملاحظة: وهذا سيكون بمثابة منحنى القياسية لتحديد تركيز شكلت المنتجات أثناء عملية التفاعل. على سبيل المثال، التخفيفات خمسة أضعاف باستخدام العازلة TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) تعمل بشكل جيد، تغطي مجموعة من 1:25 إلى 1: 15625 (5 ² -5 ^6)، ولكن يجب أن التخفيفات تعديلها تبعا لمستوى النشاط.
11. فضح هلام الجافة ومستوى باستخدام شاشة phosphorimager. قياس النشاط الإشعاعي في سلسلة تخفيف وبناء منحنى القياسية كما هو موضح ^{8 و 12}
    ملاحظة: إدراج T7 البلمرة DNA لخليط التفاعل يسمح احد لإكساءمنجم استخدام بادئات tetraribonucleotide هذا الانزيم. على النحو الأمثل، وتركيز البلمرة يجب أن تشبع لتبسيط تفسير البيانات. وهناك تركيز البلمرة من 0.4 ميكرومتر أو أعلى يعطي نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير بروتينات أخرى، مثل الحمض النووي ملزمة البروتينات واحدة الذين تقطعت بهم السبل، على أي توليف التمهيدي أو متخلفة حبلا بدء يمكن فحص بهذه الطريقة.

2. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل عن طريق صك السريع-إخماد

1. المخاليط رد فعل
   1. إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X و 0.2 ميكرومتر GP4 مسدوس، 0.2 ميكرومتر قالب ssDNA، 0.6 ملي dNTPs، 0.2 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP (بما في ذلك 0.5 MCI / مل [α- ³² ف] CTP.
   2. إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl _2.
2. تشغيل-إخماد السريع أداة تدفق
   1. تشغيل موسيقى الرابID-إخماد أداة التدفق. بعد ظهور القائمة الرئيسية، اكتب 7 على لوحة المفاتيح أداة لنقل سائق المحقنة إلى موقف البيت.
   2. حقنة موقف فتح عازلة ل"تحميل".
3. المحاقن العازلة تحميل
   1. نعلق 10 مل حقنة تحتوي عازلة لميناء محرك حقنة. تغيير حقنة موقف مقبض الباب ل"تحميل".
   2. عن طريق الحقن 10 مل، وملء عازلة أداة خزان A و B مع 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA وملء حقنة C مع حل إخماد (250 ملي EDTA، و 0.2٪ SDS). إزالة فقاعات الهواء عن طريق دفع الغطاسون في الداخل والخارج.
   3. مواقف تغيير مقبض الباب ل"النار". النوع 2 لضبط الموقف من شريط سائق حقنة. الصحافة .. "تعديل أسفل" الزر لخفض حقنة حتى يأتي عازلة خارج الحلقة الخروج: (7 تنخفض باستمرار؛ الخطوة 8 الكبيرة إلى أسفل؛ الخطوة 9 صغيرة أسفل). اكتب "ESC" للعودة إلى القائمة الرئيسية.
4. غسل الأنابيب
   1. توريمنظمة العمل ضد الجوع خط الخروج إلى فراغ. تغيير المقابض عينة إلى "إخراج". وثيقة حقنة عازلة عن طريق وضع المقابض إلى الوضع الأفقي. بدوره على فراغ وتراجع الحلقات 2 دافق في H ₂ O لمدة 10 ثانية، ثم تراجع في MeOH لمدة 10 ثانية. حلقات الجافة ويمتص الهواء ل~ 15 ثانية، أو حتى تجف.
5. عينات تحميل
   1. مقبض الباب تغير موقف عينة إلى "تحميل". وضع حل لفي 1 مل حقنة. المكونات حقنة في واحدة من الموانئ تحميل عينة. كرر حل B، ووضع في المقابل ميناء التحميل العينة.
6. جمع من الزمن نقاط
   1. في القائمة الرئيسية، اكتب 1 لتشغيل إخماد التدفق. أدخل وقت رد الفعل (الصورة) ثم اضغط على "دخول". سيتم عرض عدد حلقة رد فعل للاستخدام. التبديل إلى حاجة حلقة رد فعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4.
   2. تحويل المقابض عينة إلى "تحميل". يمزج رد فعل الحمل في الحلقات عينة حتى خارج المقصورة خلط المركزية. تحويل جميع المقابض إلى "منطقة معلومات الطيرانE ". تأكد من أن كافة المقابض هي في الموضع الصحيح.
   3. وضع أنبوب 1.5 مل على نهاية الخروج الحلقة. اضغط على "جو GO" لتشغيل رد الفعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. تحديث الحقن عازلة A و B حتى ضربوا السائق.
   4. كرر الخطوات 2.2.6.2-2.2.6.3 لكل نقطة الوقت المطلوب. استثناء: لا تقم بتحميل محلول يحتوي على بداية كاشف (أي MgCl ₂ في هذه الحالة) عندما تبريد سيطرة الصفر الوقت نقطة.
   5. عند الانتهاء من جمع العينات، أدخل "ESC" للعودة إلى القائمة الرئيسية. اضغط على "7" للعودة سائق عازلة حقنة لموقف وطنه.
7. أداة تنظيف
   1. إزالة المحاقن خليط التفاعل. تحويل عينة مقبض تحميل ل"تحميل" موقف. تحت فراغ، ويغسل كل حلقة العينة مع 10 مل من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم N، تليها 10 مل 0.3 NH ₃ ص ₄ و 10 مل MeOH.
   2. تحويل المقابض حقنة ل"تحميل" موقف. اضغط لأسفل على كل SYR 3الغطاسون إنجي لاسترداد رد فعل وإخماد المخازن. غسل المحاقن مع 5 مل H ₂ O مرتين على الأقل.
   3. ملء الحقن مرة أخرى مع 5 مل H ₂ O وتحويل المقابض إلى موقف "النار". تغيير المواقف مقبض الباب وتشغيل فراغ لإزالة H ₂ O. فلوش كما في الخطوة 2.2.4. إيقاف الصك.
      ويتم تحليل المنتجات كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،12: ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة T7 الحمض النووي بوليميريز والبروتينات النسخ الأخرى في خليط التفاعل لتحليل تأثيرها على التوليف التمهيدي أو التمديد.

3. وحيد دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل

ملاحظة: يتم إجراء أحادي دوران المقايسات التمهيدي تجميع / تمديد الخروج على نحو مماثل لردود فعل متعددة دوران، مع بعض الاختلافات الرئيسية: هذه المقايسات تتبع تحويل رديولبلد ATP إلى التمهيدي أو تمديد المنتجات، إلا أن تركيز ركائز والبروتينات هي consideraأعلى بلاي. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل تحقيق حل ميلي ثانية واحدة للسماح للتحليل رد فعل التوليف التمهيدي، لا بد من الاستفادة من آلة التدفق إخماد السريع.

1. المخاليط رد فعل.
   1. إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X، 3 ميكرومتر مسدوس GP4، 6 ميكرومتر ssDNA القالب، 0.6 ملي dNTPs، 1 ملم CTP، و 2 نانومتر [γ- ³² ف] اعبي التنس المحترفين. إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl _2.
2. سريع لإخماد عملية تدفق
   1. تنفذ تفاعلات كما هو موضح في الخطوة 2.2. إذا رغبت في ذلك، إضافة البلمرة T7 الحمض النووي أو بروتين ملزمة T7 احد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي عند تركيز من 15 ميكرومتر و 20 ميكرومتر، على التوالي. في هذه الحالة، والمنتجات تمديد تتراكم في نظام الوقت الذي يسمح لأخذ العينات اليدوية للتفاعل.

تحليل 4. البيانات

1. تناسب منحنيات تقدم المنتج لالأقل- غير الخطيةالساحات النماذج باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا قادرة على المربعات الصغرى نوبات و / أو التكامل العددي. فإن تفاصيل العملية تختلف مع البرنامج يعمل، ولكن أقل من أشكال معممة من المعادلات المستخدمة لتركيب البيانات.
2. تحديد معدل تكوين المنتج من عدة تفاعلات التخليق دوران التمهيدي من المناسب للتقدم منحنيات لمعادلة خطية. إذا كان هناك انحناء كبير، استخدام طريقة معدل الأولي ^{13 و 14} عن طريق تركيب البيانات إلى وظيفة واحدة الأسي: ص = أ (ه ^{- ك ر)،} حيث ص هو تركيز المنتج، A هي السعة رد فعل، ك هو ثابت معدل لاحظ، ر حان الوقت، في ثوان. المنحدر من خط المماس في الوقت = 0 هو المعدل الأولي.
   ملاحظة: صالح قبل ثابتة تفاعلات التخليق التمهيدي الدولة لمعادلة خطية أو معادلة حالة ما قبل مستقرة انفجار ذ = A (ه ^- _بو ^كRST ^ر) + معدل _SS ر، حيث A هي السعة رد فعل، ك _انفجار هو ثابت المعدل الملاحظ للانفجار حالة ما قبل ثابت، ومعدل _ss غير أن حالة استقرار معدل _SS = ك _القط [أنزيم])، تي آن الأوان ، في ثوان. تناسب-دوران واحد تفاعلات التخليق التمهيدي منحنيات إلى وظيفة ذ = A واحد الأسي التقدم (ه ^{- ك ر).} في حالة GP4، تناسب البيانات عن طريق التكامل العددي ^15، إلى نموذج مع ثلاث خطوات التكثيف NTP، حيث كل وسيطة هو في حالة توازن مع الانزيم، وذلك باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا.

النتائج

وقد تم الحصول على النتائج الموضحة في الشكل 1A كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول، أي عن طريق أخذ عينات رد فعل التوليف التمهيدي يحفزه GP4 في ظل ظروف متعددة دوران يدويا. هنا، مجموعة واسعة من المنتجات بعد الكهربائي للهلام يمكن مل?...

Discussion

العامل الأكثر أهمية في أداء هذه التجارب هو توافر انزيم المنقى نشطة للغاية. خلال عملنا مع GP4، على سبيل المثال، وجدنا أن تخزين الإنزيم المنقى في المخزن (20 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم DTT) التي تحتوي على 50٪ الجلسرين في -20 درجة مئوية يؤدي إلى انخف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A