Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Riepilogo

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Abstract

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Introduzione

La replicazione del DNA è una caratteristica conservato di tutta la vita cellulare. Mentre l'identità e il numero dei componenti di replica variano ampiamente, i meccanismi generali sono condivisi tra evoluzione ^1. Qui, descriviamo gel a base, discontinue esperimenti cinetici, utilizzando substrati radioattivi, volti a comprendere la cinetica della sintesi del DNA in ritardo filamento in vitro da componenti del replisoma T7. Il meccanismo di replicazione del batteriofago T7 è molto semplice, composto da soli quattro proteine (la DNA polimerasi, GP5, e il suo fattore processività, E. coli tioredossina, le bifunzionali GP4 primasi-elicasi, e la proteina legante il DNA a singolo filamento, GP2. 5) ^2. Questa caratteristica lo rende un sistema interessante modello per studiare i meccanismi conservati biochimici coinvolti nella replicazione del DNA.

Particolare enfasi è posta sulla formazione di primer ribonucleotide da T7 DNA primasi, una critical passo per l'inizio della sintesi del DNA. Inoltre, si può anche esaminare l'utilizzo di questi primer di polimerasi T7 DNA o altre proteine ​​di replica includendoli nella miscela di reazione. Il T7 primasi-elicasi, GP4, catalizza la formazione di primer per la sintesi del DNA a specifiche sequenze di DNA chiamati siti di riconoscimento primasi, o PRS, (5'-GTC-3 '). La citosina nel PRS è criptico, è essenziale per il riconoscimento del sito, ma non viene copiato nel prodotto ^3. Il primo passo nella sintesi di primer da gp4 comporta la formazione del dinucleotide pppAC, che viene poi estesi ad un trimero, ed eventualmente primers tetranucleotide funzionali pppACCC, pppACCA o pppACAC seconda della sequenza nel modello ^4. Questi primer possono essere utilizzati da polimerasi T7 DNA per iniziare la sintesi di DNA, che è anche un processo gp4 assistito ^{5, 6.} A questo proposito, il primasidominio stabilizza i brevissimi tetraribonucleotides con il modello, impedendo loro di dissociazione, si impegna DNA polimerasi in maniera atta a garantire il primer / modello nel polimerasi sito attivo ^7. Questi passaggi (RNA sintesi di primer, primer per handoff polimerasi, ed estensione) si ripetono in cicli multipli di replicare il filamento in ritardo e devono essere coordinati con la replicazione del filamento principale.

I saggi descritti qui sono altamente sensibili e possono essere eseguite in tempi moderata. Tuttavia, essi sono relativamente bassi-throughput e grande cura deve essere esercitata in uso e lo smaltimento dei materiali radioattivi. A seconda della velocità con cui la reazione procede, si potrebbe impiegare uno strumento rapido raffreddamento per ottenere campioni su scale temporali suscettibili per un'analisi significativa degli insegnamenti tempo di reazione sia stazionario o lo stato pre-stazionario. Recentemente, abbiamo usato saggi descritti qui per fornire evidence dell'importanza del rilascio primer dominio primasi del gp4 nell'avvio di frammenti di Okazaki. Inoltre, abbiamo trovato prove di un ruolo di regolamentazione per il T7 DNA a singolo filamento di proteine, gp2.5 vincolante, nel promuovere la formazione di primer efficiente e l'utilizzo ^8.

Protocollo

NOTA: Seguire tutte le normative istituzionali per quanto riguarda l'uso sicuro e lo smaltimento di materiale radioattivo, incluso ma non limitato a, l'utilizzo di dispositivi di protezione individuale, come guanti, occhiali di sicurezza, camice da laboratorio, e scudi acrilico appropriate.

NOTA: Il buffer standard consiste di 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM di potassio glutammato, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (questo buffer viene pre-fatta ad una concentrazione 5x) e 0,3 mM di ogni dNTP. Proteine replica T7 sono purificati come descritto ^{8, 9, 10.} DNA a singolo filamento contenente un singolo sito di riconoscimento T7 primasi (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') possono essere acquistati da una varietà di aziende sintesi del DNA (la lunghezza il ssDNA può dipendere l'enzima di scelta, per T7 primasi, un pentamero è la lunghezza minima template per sintetizzare un primer integrale ¹1, come il criptico C è essenziale, tuttavia, se il primer deve essere prorogato di polimerasi, nucleotidi aggiuntivo deve essere presente alla fine del 3 'del modello. Le reazioni vengono avviate mediante aggiunta di una concentrazione finale di 10 mM MgCl ₂ e incubate a 25 ° C. Campionamento manuale funziona bene per time-punti pari o superiore a 5 secondi. Se sono necessari punti temporali più brevi di questo, si consiglia di utilizzare uno strumento di flusso rapido tempra per ottenere dati precisi.

1. Multiple-fatturato Primer Sintesi Reaction di campionamento manuale

1. Prima di iniziare l'esperimento, un'aliquota 2 ml di tampone dye formamide (93% (v / v) formammide, 50 mM EDTA, 0,01% xilene cianolo e 0,01% blu di bromofenolo) in 8 1.5 mL tubi di polipropilene. In generale, il numero di tubi è uguale al numero di punti temporali analizzati.
2. Preparare una miscela costituita da 20 l 1x tampone, 0,1 mM ATP e CTP, 0,25 mCi / mL [α- ³² P] CTP, 0.1 micron SSDmodello di NA, e 0,1 micron GP4 (espressa come concentrazione esamero - 0,6 micron monomero).
3. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min.
4. Rimuovere 2 ml della miscela utilizzando una pipetta e mescolare con 2 ml di buffer colorante formammide in una provetta da 1,5 ml preparata al punto 1.1 per il controllo nessuna reazione (tempo zero).
5. Aggiungere 2 ml di 0,1 M MgCl ₂ di miscela di reazione (ad una concentrazione finale di 10 mM).
6. prelevare manualmente 2 campioni ml di miscele di reazione utilizzando una pipetta ad intervalli di 10 s e mescolare con la tintura formammide dosata in provette da 1,5 ml preparata al punto 1.1.
7. campioni di calore a 95 ° C per 5 min in un blocco di calore.
8. Caricare aliquote di campioni su un gel denaturante. I piccoli prodotti di primer tetraribonucleotide sintetizzati dal primasi T7 sono risolti bene su un 0,4 mm di spessore 25% acrilammide: bisacrylamide (19: 1), 3 M urea, 1x TBE (100 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).
9. Mettere tutto il gel sulla crcarta PHY e coprire con pellicola trasparente. gel secco utilizzando un essiccatore gel.
10. Preparare una serie di diluizioni del resto della miscela di reazione e macchiare lo stesso volume caricati sul gel cromatografia su carta, cioè, individuare 4 ml della diluizione se 4 ml di campione sono stati caricati.
    NOTA: Questo servirà come la curva standard per determinare la concentrazione dei prodotti formati durante la reazione. Ad esempio, cinque diluizioni utilizzando tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funzionano bene, coprono una gamma 1:25 a 1: 15.625 (5 ² -5 ^6), ma le diluizioni dovrebbero essere regolato a seconda del livello di attività.
11. Esporre gel secco e standard utilizzando uno schermo phosphorimager. Quantificare la radioattività nella serie di diluizioni e costruire una curva standard come descritto ^{8, 12}
    NOTA: L'inclusione di T7 DNA polimerasi alla miscela di reazione consente di Exala mia l'uso di primer tetraribonucleotide da questo enzima. In modo ottimale, la concentrazione polimerasi va saturando per semplificare l'interpretazione dei dati. Una concentrazione polimerasi di 0,4 micron o superiore dà buoni risultati. Inoltre, l'effetto di altri proteine, come legame al DNA a singolo filamento di proteine, su entrambi sintesi primer o ritardo-strand iniziazione può essere esaminato in questo modo.

2. Multiple-fatturato Primer Sintesi di reazione con uno strumento Rapid-tempra

1. Preparazione di miscele di reazione
   1. Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 0,2 micron GP4 esamero, 0,2 um modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 0,2 mM ATP e CTP (compresi 0,5 mCi / ml [α- ³² P] CTP.
   2. Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl _2.
2. Il funzionamento dello strumento flusso rapido tempra
   1. Accendere rapstrumento flusso id-tempra; dopo la visualizzazione del menu principale, 7 sulla tastiera dello strumento per spostare la siringa temporizzata alla posizione iniziale.
   2. posizione siringa aperta buffer "LOAD".
3. Siringhe Caricamento tampone
   1. Allegare una contenente tampone 10 ml siringa alla porta dell'unità siringa. Cambiare posizione della manopola siringa per "LOAD".
   2. Utilizzando 10 siringhe ml, riempire tampone strumento serbatoio A e B con 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA e riempire la siringa C con soluzione di raffreddamento (250 mM EDTA e 0,2% SDS). Rimuovere le bolle d'aria spingendo pistoni dentro e fuori.
   3. posizioni Modifica manopola su "FIRE". Tipo 2 per regolare la posizione della barra siringa temporizzata. Premere il tasto "REGOLAZIONE DOWN" per abbassare la siringa fino a tampone viene fuori il loop di uscita: (7-va giù continuamente; 8-grande passo verso il basso; 9-piccole passo verso il basso). Tipo "ESC" per tornare al menu principale.
4. tubi Wash
   1. Attlinea di uscita ach al vuoto. Modificare le manopole di esempio a "filo". Vicino tampone siringa impostando le manopole in posizione orizzontale. Accendere vuoto e immergere le anse a filo 2 in H ₂ O per 10 s, poi immergere in MeOH per 10 s. loop Dry aspirando aria per ~ 15 s, o fino a secco.
5. Caricamento campioni
   1. Cambiare posizione della manopola di esempio per "LOAD". Mettere la soluzione A alla siringa da 1 ml. Inserire la siringa in una delle porte di carico campione. Ripetere l'operazione per la soluzione B, e posto in fronte al porto di carico del campione.
6. Raccolta dei termini di punti
   1. Nel menu principale, digitare 1 per eseguire tempra-flow. Inserire tempo di reazione (s) e premere il tasto "ENTER". verranno visualizzati il ​​numero ciclo reazione da usare. Passare a ciclo reazione desiderata. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4.
   2. Girare le manopole di esempio per "caricare". reazione del carico mescola in loop del campione fino alle porte del vano di miscelazione centrale. Girare tutte le manopole a "FIRE ". Verificare che tutte le manopole siano nella posizione corretta.
   3. Mettere 1,5 ml di tubo sulla fine del ciclo di uscita. Premere il tasto "Go" per avviare la reazione. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4. Ricarica siringhe tampone A e B fino a colpire il conducente.
   4. Ripetere i passaggi 2.2.6.2-2.2.6.3 per ogni punto di tempo desiderato. Eccezione: Non caricare soluzione contenente il reagente di partenza (cioè, MgCl ₂ in questo caso) quando tempra il controllo del tempo-zero.
   5. Al termine la raccolta di campioni, immettere "ESC" per tornare al menu principale. Premere il tasto "7" per tornare conducente tampone siringa alla sua posizione iniziale.
7. Strumento clean-up
   1. Rimuovere reazione siringhe miscela. Ruotare la manopola di carico campione in posizione "LOAD". Sotto vuoto, lavare ogni ciclo campione con 10 mL di 0,2 N NaOH, seguito da 10 mL 0,3 NH ₃ PO ₄ e 10 mL di MeOH.
   2. Girare le manopole siringa in posizione "LOAD". Premere verso il basso tutti i 3 syrpistoni Inge per recuperare i buffer di reazione e di tempra. Lavare siringhe con 5 mL H ₂ O almeno due volte.
   3. Riempire le siringhe di nuovo con 5 ml di H ₂ O e girare le manopole in posizione "FIRE". Cambiare posizioni della manopola e accendere vuoto per rimuovere H ₂ O. filo come al punto 2.2.4. Spegnere strumento.
      Nota: i prodotti vengono analizzati come descritto nei passaggi 1.7-1.12. Inoltre, polimerasi T7 DNA e altre proteine ​​replica possono essere aggiunti nella miscela di reazione per analizzare il loro effetto sulla sintesi primer o estensione.

3. Single-fatturato Primer Sintesi di reazione

NOTA: Single-fatturato test di primer sintesi / estensione vengono effettuate in modo simile a reazioni multiple di fatturato, con alcune importanti differenze: questi test seguono la conversione del radiomarcato ATP in primer o di estensione prodotti, tuttavia la concentrazione di substrati e proteine sono consideBly più alto. Inoltre, per raggiungere risoluzione millisecondo per consentire l'analisi della reazione di sintesi di primer, si deve utilizzare una macchina flusso rapido raffreddamento.

1. Preparazione delle miscele di reazione.
   1. Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 3 micron esamero GP4, 6 micron modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 1 mM CTP, e 2 nm [γ- ³² P] ATP. Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl _2.
2. Il funzionamento del flusso Rapid-tempra
   1. Effettuare le reazioni come descritto al punto 2.2. Eventualmente aggiungere polimerasi T7 DNA o proteina legante T7-stranded DNA singola ad una concentrazione di 15 mM e 20 mM, rispettivamente. In questo caso, i prodotti di estensione si accumulano in un regime di tempo che consente il campionamento manuale della reazione.

Analisi 4. I dati

1. Fit curve di avanzamento dei prodotti a dei minimi non linearemodelli piazze utilizzando il software disponibile in commercio in grado di minimi quadrati adatta e / o integrazione numerica. I dettagli dell'operazione saranno variano a seconda del software utilizzato, ma al di sotto sono forme generalizzate di equazioni utilizzate per il montaggio dei dati.
2. Determinare la velocità di formazione del prodotto di molteplici reazioni di sintesi fatturato iniettore inserendo progredire curve ad una equazione lineare. Se c'è una significativa curvatura, utilizzare il metodo tasso iniziale ^{13, 14} inserendo i dati ad una singola funzione esponenziale: y = A (e ^{- k t),} dove y è la concentrazione del prodotto, A è l'ampiezza reazione, k è la costante di velocità osservata, t è il tempo, espresso in secondi. La pendenza della retta tangente al tempo = 0 è il tasso iniziale.
   NOTA: reazioni di sintesi di primer stato Fit pre-stabili ad una equazione lineare o per l'equazione di stato pre-stazionario scoppiare y = A (e ^- _BU ^Kprimo ^t) + tasso _ss t, dove A è l'ampiezza di reazione, k _scoppio è la costante di velocità osservata per lo scoppio stato pre-stazionario, il tasso _ss è lo stato stazionario tasso _ss = k _gatto [enzima]), t è il tempo , in secondi. Fit reazioni di sintesi di primer singolo fatturato progresso curve ad un singolo esponenziale funzione y = A (e ^{- k t).} Nel caso di GP4, inserire i dati per integrazione numerica ^15, ad un modello con tre NTP gradini di condensazione, in cui ogni intermedio è in equilibrio con l'enzima, utilizzando un software disponibile in commercio.

Risultati

I risultati mostrati in figura 1A sono stati ottenuti come descritto al punto 1 del protocollo, cioè, campionando manualmente una reazione di sintesi di primer catalizzata da GP4 in condizioni multiple-turnover. Qui, una gamma di prodotti dopo elettroforesi su gel può essere osservato mediante CTP marcato con ³² P alla α-posizione in reazioni di sintesi di primer (Figura 1A). Il precursore marcato, CTP, mostra la m...

Discussione

Il fattore più importante nel realizzare questi esperimenti è la disponibilità di enzima purificato altamente attiva. Durante il lavoro con GP4, per esempio, abbiamo scoperto che la memorizzazione dell'enzima purificato in tampone (20 mM fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) contenente 50% glicerolo a -20 ° C porta ad una riduzione l'attività specifica del preparato nell'arco di pochi mesi. Pertanto ora flash congelamento piccole aliquote di gp4 purificato in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A